植物縮合單寧抗氧化作用機(jī)制的研究進(jìn)展

彭 凱 王國霞 孫育平 陳 冰 莫文艷 黃燕華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640）

隨著養(yǎng)殖規(guī)?；图s化的迅猛發(fā)展，動物在養(yǎng) 殖過程中所面臨的人為活動、環(huán)境變化、飼料和水體中有毒有害物質(zhì)等各種應(yīng)激因子日益增加，從而造成氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是多種疾病發(fā)生的重要病理機(jī)制之一。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體組織和細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加，導(dǎo)致活性氧家族累積而引起細(xì)胞氧化損傷，使機(jī)體抗氧化和免疫力下降并引發(fā)大規(guī)模病害，影響生產(chǎn)性能、產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全，同時給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。動物的健康程度與機(jī)體抗氧化防御體系的能力密切相關(guān)。應(yīng)用天然抗氧化活性物質(zhì)提高動物的抗應(yīng)激能力、降低病害的發(fā)生，是高效健康養(yǎng)殖和維持養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，也是動物營養(yǎng)調(diào)控的研究熱點(diǎn)之一。但由于動物內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激途徑及自身防御機(jī)制仍不完全清楚，導(dǎo)致外源添加劑對機(jī)體抗氧化作用的調(diào)控機(jī)理不明，從而嚴(yán)重制約了抗氧化活性物質(zhì)的應(yīng)用。

縮合單寧（Condensed tannins）是由黃烷-3-醇單體組成的多酚化合物，是一種天然、綠色、安全的生物抗氧化劑，其抗氧化功能在食品和醫(yī)療行業(yè)已被人們所認(rèn)知[1]?？s合單寧屬于植物次級代謝產(chǎn)物，在自然界中分布廣泛，常見于喬木、灌木、草本植物（百脈根）、豆科牧草（紅豆草、紫色達(dá)利菊）、谷物（高粱、黍、大麥、木薯）和水果（葡萄、黑莓、柿子、香蕉）之中，主要存在于細(xì)胞壁或植物的莖、皮、葉、花、種子之內(nèi)。與化學(xué)合成的抗氧化劑相比，縮合單寧具有安全性高、殘留及毒副作用小、抗氧化活性高等優(yōu)點(diǎn)，在抵御或減輕氧化應(yīng)激對機(jī)體的危害、減少動物疾病、提高生產(chǎn)性能等方面表現(xiàn)出巨大的研究價值和開發(fā)潛力。在抗氧化過程中，縮合單寧通過與苯酚耦合發(fā)生低聚反應(yīng)，導(dǎo)致自身反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加，因此比低分子量的多酚化合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，縮合單寧具有提高機(jī)體抗氧化能力、清除自由基的功能，這對于預(yù)防疾病、修復(fù)受傷機(jī)體、增強(qiáng)動物健康等具有重要意義。本文概括了近年來縮合單寧抗氧化生物活性及其作用機(jī)理的研究進(jìn)展，介紹了縮合單寧在促進(jìn)動物抗氧化應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體健康上的應(yīng)用。

1 縮合單寧對抗氧化酶的調(diào)控作用

已有研究表明，提高動物機(jī)體抗氧化能力的根本措施是通過提高酶促體系的功能[3]。天然多酚類化合物作為抗氧化劑的研究已被廣泛報道[4-5]。研究表明，單寧比低分子量多酚或非酚類抗氧化劑具有更強(qiáng)的抗氧化能力[2]。關(guān)于體外試驗(yàn)對于單寧的抗氧化活性已有大量報道[6-9]，而體內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)了單寧能夠提高動物血液[10-11]、肌肉[12]和肝臟[13]的抗氧化能力。Peng等[14]研究表明，縮合單寧通過提高血清總抗氧化能力和過氧化氫酶（CAT）活性增強(qiáng)綿羊的抗氧化能力。Franki?等[15]指出，栗木單寧可通過降低尿中丙二醛（MDA）濃度和減少血清淋巴細(xì)胞DNA損傷來緩解仔豬的氧化應(yīng)激。Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽縮合單寧通過降低肉雞血漿一氧化氮和MDA 濃度，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，進(jìn)而減少機(jī)體氧化損傷。劉華偉[17]在兔日糧中添加栗樹縮合單寧可顯著清除對1,1-二苯基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基，降低肝臟中MDA 含量，提高SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，增加肝臟中GSH-Px、SOD基因的表達(dá)量。

2 縮合單寧對Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化信號通路的調(diào)控作用

由氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧自由基直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)病的根本原因。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路，即Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）-核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號通路，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化機(jī)制中最重要的通路。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種抗氧化酶表達(dá)的關(guān)鍵通路。Nrf2以Ke?ap1-Nrf2/ARE 信號通路介導(dǎo)并激活下游多種抗氧化相關(guān)基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而減輕活性氧自由基（ROS）和親電子物質(zhì)引起的細(xì)胞損傷，在細(xì)胞防御保護(hù)和維持機(jī)體氧化與抗氧化生理平衡中發(fā)揮著重要作用，是近年來抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，大量研究報道了Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在抵御氧化應(yīng)激、炎癥、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多種病理生理進(jìn)程中發(fā)揮的重要角色。正常生理狀態(tài)下，Nrf2以非活性狀態(tài)存在于胞漿中，與Ke?ap1 通過與同源結(jié)構(gòu)域Neh2 區(qū)偶聯(lián)并與胞漿肌動蛋白結(jié)合被錨定在胞漿中；當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體處于氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)的刺激下，Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而與Nrf2解偶聯(lián)，解離的Nrf2隨后進(jìn)入細(xì)胞核與ARE啟動子結(jié)合，并調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[18]。Nrf2被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞對抗異源性物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]。關(guān)于Nrf2的活化機(jī)制，近年來研究發(fā)現(xiàn)激酶通路，包括絲裂酶原激活蛋白酶（MAPKs）、磷脂酰肌醇酶（PI3K）、蛋白激酶（PCK）等均參與Nrf2 的激活，原理是蛋白激酶能通過直接磷酸化Nrf2 的方式促使其與Keap1 解離，激活Nrf2[20]。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控是十分精細(xì)和復(fù)雜的，目前已發(fā)現(xiàn)該信號通路調(diào)節(jié)的可編碼內(nèi)源性保護(hù)基因超過200個，其激活的基因種類取決于激活劑類型和激活方式，且存在其他信號通路的參與。多數(shù)文獻(xiàn)報道，Keap1-Nrf2/ARE信號通路的激活可啟動下游一系列靶基因，如CAT、SOD、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、醌氧化還原酶（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）以及血紅素加氧酶（HO-1）的表達(dá)[21-22]，進(jìn)而抵抗各種刺激對機(jī)體產(chǎn)生的氧化損傷。當(dāng)前對Keap1-Nrf2/ARE信號通路的研究集中于抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，這也是信號通路調(diào)控的關(guān)鍵一步，抗氧化蛋白的表達(dá)可以清除過多的由于氧化還原失衡而增加的自由基，有助于維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡，使細(xì)胞免受損傷。

目前，少有文獻(xiàn)報道縮合單寧對Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控作用。Erlank 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，叔丁基對苯二酚、白藜蘆醇和姜黃素等多酚類化合物激活了細(xì)胞Nrf2/ARE 信號通路并增加了下游解毒酶的基因表達(dá)，Nrf2 和NQO1 的活性顯著提高。Han 等[24]指出，茶多酚提高了Nrf2 和HO-1 的基因表達(dá)量，增強(qiáng)了大鼠的抗氧化能力。Tamaki等[25]研究表明，白藜蘆醇能激活Nrf2/ARE 信號通路，改善8-羥基脫氧鳥苷和抗炎因子的基因表達(dá)水平以及NO 的代謝，從而減緩大鼠牙周炎。陳雁[26]發(fā)現(xiàn)，葡萄籽縮合單寧可激活Nrf2/ARE 信號通路，促進(jìn)腎臟中Nrf2 及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，降低腎臟氧化損傷及細(xì)胞凋亡率。趙嬌[27]研究表明，葡萄籽縮合單寧通過提高Keap1 的mRNA表達(dá)量以減輕活性氧自由基對仔豬肝臟的氧化損傷；通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78 的mRNA 表達(dá)量和肝臟caspase-12 含量以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化損傷。蓮子皮縮合單寧可有效激活Nrf2/ARE 信號通路，促進(jìn)Nrf2 解離，從而提高抗氧化保護(hù)基因HO-1的轉(zhuǎn)錄水平[28]。飼料中添加400 mg/kg 葡萄籽縮合單寧不僅不影響花鱸幼魚的生長性能，還能提高血清和肝臟抗氧化酶活性，并通過上調(diào)Nrf2基因表達(dá)降低10 h低氧脅迫累計死亡率[29]。

3 縮合單寧與腸道抗氧化細(xì)菌的相互作用

腸道是動物主要的消化代謝器官，也是縮合單寧作用的第一個靶點(diǎn)。然而，縮合單寧如何被腸道利用，以及提高腸道抗氧化狀態(tài)的作用機(jī)理尚不明確。縮合單寧是由黃烷-3-醇單體組成的聚合物，分子量在1 000～20 000 Da 之間[30]。黃烷-3-醇單體容易被腸道直接吸收而發(fā)揮作用，但低聚合度或高聚合度的縮合單寧并不能直接被腸道利用，而是被腸道細(xì)菌降解或轉(zhuǎn)化[31]。因此，人們推測縮合單寧的抗氧化作用可能存在其他重要的調(diào)控途徑，比如可能是通過與腸道微生物的相互作用實(shí)現(xiàn)的。通過在飼料中添加益生菌，如乳酸菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、雙歧桿菌（Bifidobaterium）、擬桿菌（Bacteroides）、腸球菌（Enterococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）等，可增加動物腸道有益菌數(shù)量，修復(fù)腸黏膜損傷，從而增強(qiáng)宿主抵抗環(huán)境應(yīng)激和腸道疾病的能力[32]。

細(xì)菌的抗氧化性是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[33]。Lin等[34]報道，乳酸菌Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 和雙歧桿菌Bifidobateriumlongum ATCC 15708均能夠顯著抑制血脂的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除2, 2-二苯基-1-苦基苯肼自由基（DPPH），發(fā)揮抗氧化效果。相似地，乳酸菌Lactobacillus fermentum被定義為抗氧化細(xì)菌，因?yàn)槠渚哂星宄钚匝酢⒌挚钩蹶庪x子自由基和過氧化氫的作用[35]。乳酸菌Lactobacillus plantarum KCTC 3099 和C88 可通過與金屬離子Cu2+和Fe2+發(fā)生螯合，或通過增強(qiáng)抗氧化酶活性等方式清除活性氧自由基，增強(qiáng)抗氧化防御體系[36-37]。此外，一些乳酸菌被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生非酶類抗氧化活性物質(zhì)，如谷胱甘肽、硫氧化還原蛋白，間接清除自由基[35]。

腸道菌群是多酚發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵因素[38]。體內(nèi)和體外研究均已證實(shí)，黃烷-3-醇單體和單寧可促進(jìn)乳酸菌（Lactobacillus）和擬桿菌（Bacteroides）增殖，抑制梭菌（Clostridium）和葡萄球菌（Staphylococ?cus）生長，從而改善腸道健康[39]。研究發(fā)現(xiàn)，紫色達(dá)利菊縮合單寧可顯著抑制大腸桿菌Escherichia coli ATCC 25922 和35218 的生長，促進(jìn)乳球菌（Lactococ?cus）和明串珠菌（Leuconostoc）的增殖[40-41]。最新研究表明，縮合單寧可降低花鱸腸道梭菌（Fusobacteria）豐度，增加變形菌（Proteobacteria）豐度，提高花鱸血清和肝臟的抗氧化力[42]。在縮合單寧的干預(yù)下，腸道微生物結(jié)構(gòu)組成可能發(fā)生變化，優(yōu)勢菌可直接發(fā)揮抗氧化作用，或者通過其代謝產(chǎn)物間接調(diào)控機(jī)體抗氧化狀態(tài)。相反，縮合單寧也能夠被腸道細(xì)菌降解或轉(zhuǎn)化，其代謝產(chǎn)物對于增強(qiáng)機(jī)體抗氧化和維持腸道健康的作用不容忽視[43]。黃烷-3-醇，如兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素，可以被擬球梭菌（Clostridium coc?coides）和雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）降解，生成丙酸、戊酸和戊內(nèi)酯等物質(zhì)[44]。研究表明，日糧縮合單寧通過小鼠腸道菌群的降解產(chǎn)物還包括苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸、苯乳酸、間苯三酚和異丙醇及其衍生物，而在人腸道中的主要代謝產(chǎn)物為乙酸、苯丙酸、丙酸和戊酸[45]。盡管縮合單寧的微生物降解產(chǎn)物及其對腸道健康的保護(hù)作用已被人們所關(guān)注，現(xiàn)有研究仍然局限于少數(shù)單一菌屬，且作用機(jī)理不明確，縮合單寧如何在魚類腸道中代謝并發(fā)揮作用還不清楚。因此，當(dāng)前研究的努力方向在于明確縮合單寧與腸道微生物的互作規(guī)律，以及探討縮合單寧抗氧化作用的微生態(tài)機(jī)理。

4 結(jié)語

植物縮合單寧作為一種理想的抗生素替代品能夠有效增強(qiáng)動物抗氧化能力，調(diào)節(jié)動物腸道健康，但其作用機(jī)制尚不清楚。以往研究多停留在抗氧化酶活性及其基因表達(dá)水平。近年來發(fā)現(xiàn)，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在抵御動物機(jī)體抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮的重要角色，縮合單寧可激活Keap1-Nrf2/ARE 信號通路，上調(diào)抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化狀態(tài)。腸道菌群作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分，其在抵御腸道氧化應(yīng)激中發(fā)揮直接抗氧化性或關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。縮合單寧為聚合物，基本不被腸道吸收，而腸道菌群在縮合單寧發(fā)揮抗氧化作用中起關(guān)鍵作用。那么一系列科學(xué)問題值得我們深入探討：①縮合單寧對動物腸道抗氧化性細(xì)菌的調(diào)控作用及其作用機(jī)理；②縮合單寧對動物腸黏膜損傷修復(fù)和結(jié)構(gòu)完整性的影響；③縮合單寧的微生物降解產(chǎn)物與腸道抗氧化通路有何內(nèi)在聯(lián)系？未來研究應(yīng)當(dāng)更多關(guān)注上述一系列科學(xué)問題的解答，這將有助于我們更加明確縮合單寧調(diào)節(jié)腸道健康和提高機(jī)體抗氧化作用的分子機(jī)制，亦為營養(yǎng)調(diào)控動物抗氧化作用提供理論依據(jù)和新思路。