芍藥苷抑制Src/STAT3信號(hào)通路協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移

高卓維 陳廣鴻 符路娣

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院（廣東佛山528300）；2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室（廣州510515）；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（廣州510405）

膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常常見的惡性腫瘤，具有生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)、病死率高和致殘率高的特點(diǎn)，約占成人惡性腦腫瘤的81%［1］。目前，膠質(zhì)瘤主要的臨床治療方法是手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放療、化療的綜合療法［2-3］。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的一線化療藥物，具有明確的療效。然而替莫唑胺的療效經(jīng)常受到藥物敏感性下降和化療耐藥性的限制。既往研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合中藥，能夠增加抗癌療效和減輕單藥不良反應(yīng)。芍藥苷（Paeoniflorin）是臨床常用中藥芍藥內(nèi)的主要有效成分，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有抗腫瘤作用，能夠抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)［4］。本研究對(duì)芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，觀察聯(lián)合作用對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖和遷移的影響，探討芍藥苷協(xié)同替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的量效關(guān)系和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料c-Myc（#18583）、MMP-2（#40994）、MMP-9（#13667）、GAPDH（#5174）抗體購(gòu)自美國(guó)CST生物科技有限公司，Src（ab109381）、p-Src（Tyr419，ab185617）、STAT3（ab68153）、p-STAT3（Tyr705，ab76315）、CyclinD1（ab134175）購(gòu)自美國(guó)Abcam有限公司。芍藥苷由廣東藥科大學(xué)仇志坤博士饋贈(zèng)、替莫唑胺購(gòu)買自左克有限公司。MTS購(gòu)買自Promega有限公司。結(jié)晶紫染色液購(gòu)買自凱基生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購(gòu)買自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法提取膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞。其中：人腦膠質(zhì)瘤瘤體組織來(lái)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院神經(jīng)外科術(shù)后的病理標(biāo)本。成功提取的原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在生長(zhǎng)至80%進(jìn)行傳代，用0.25%胰蛋白酶（含0.2%EDTA）消化細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞控制在4代以內(nèi)。本研究經(jīng)過原佛山市順德區(qū)中醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.3 MTS 法檢測(cè)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化、離心，調(diào)整細(xì)胞密度至5 × 103個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至約80%后，分別給予不同濃度的芍藥苷或替莫唑胺處理，培養(yǎng)24或48 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTS稀釋液（將MTS試劑以1∶6的比例加入至含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基中），于37°C，5%CO2孵箱孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=［OD-OD（空白）］/［OD（對(duì)照）-OD（空白）］×100%。在確定芍藥苷和替莫唑胺的抑制濃度后，檢測(cè)兩者藥物組合對(duì)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力的影響。通過繪制等效線圖和計(jì)算組合指數(shù)CI（CI ＜1，協(xié)同作用；CI = 1，相加作用；CI ＞1，拮抗作用）來(lái)確定最佳協(xié)同作用的藥物比例。以此為依據(jù)設(shè)定給藥濃度進(jìn)行后續(xù)EdU染色、Transwell細(xì)胞遷移和Western blot檢測(cè)。

1.4 EdU 染色檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化、離心、調(diào)整細(xì)胞密度至5 × 103個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至約80%后，分為對(duì)照組、芍藥苷組、替莫唑胺組、芍藥苷+替莫唑胺組，并在培養(yǎng)基中加入EdU處理48 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后分別依次采用1×Apollo?染色液和1×Hoechst33342反應(yīng)液室溫孵育各30分鐘。在熒光顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)（呈藍(lán)色）及EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（呈紅色），EdU陽(yáng)性百分比= EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，按照約1 × 105個(gè)/孔的細(xì)胞密度分別用500 μL含不同藥物的含藥無(wú)血清DEME培養(yǎng)基重懸后加入Transwell小室上室，下室置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，孵箱中孵育16 h，孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色液染色15 min，最后棉簽旋轉(zhuǎn)輕柔地擦去上室未遷移的細(xì)胞。于倒置顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。Image J軟件統(tǒng)計(jì)每組遷移細(xì)胞數(shù)。

1.6 反向藥效團(tuán)對(duì)接即使探索芍藥苷治療膠質(zhì)瘤的作用靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）芍藥苷的空間構(gòu)象，將芍藥苷的3D結(jié)構(gòu)上傳到反向藥效團(tuán)對(duì)接分析數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper（http：//lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）進(jìn)行分析，尋找芍藥苷潛在作用靶點(diǎn)。候選靶點(diǎn)經(jīng)過篩選后通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）分析其相互作用。

1.7 細(xì)胞蛋白檢測(cè)將原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至80%將細(xì)胞分為對(duì)照組、芍藥苷組、替莫唑胺組、芍藥苷+替莫唑胺組。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS洗滌。每孔加入100 μL RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解。收集裂解五轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，漩渦振蕩3 min，然后4 ℃，12 000 ×g，離心15 min。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶封閉PVDF膜，并用TBST溶液洗滌3次，每次5 min/次。一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜。洗滌后在室溫下與二抗（1∶5 000）孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。IC50計(jì)算采用概率分析法，組間多樣本均數(shù)比較采用ONE WAY ANOVA進(jìn)行分析，P ＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷和替莫唑胺對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力的影響結(jié)果如圖1示，替莫唑胺和芍藥苷單藥對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，并且其抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。作用24、48 h后替莫唑胺的IC50值分別是404.15、191.57 μmol/L。作用24、48 h后芍藥苷的IC50值分別是96.79、69.85 μmol/L。兩藥聯(lián)合等效圖結(jié)果顯示，替莫唑胺與芍藥苷聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯增強(qiáng)。與6.25、12.5、25 μmol/L的芍藥苷聯(lián)合應(yīng)用處理后，替莫唑胺的IC50值分別為159.68、107.84、65.54 μmol/L，較單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的IC50明顯降低（P ＜0.05）。等效線圖分析顯示，芍藥苷聯(lián)合替莫唑胺的CI值明顯小于1，在芍藥苷濃度為6.25、12.5、25 μmol/L時(shí)CI值分別為0.96、0.82、0.86提示兩藥聯(lián)合呈明顯協(xié)同作用。

圖1 芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力Fig.1 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the cell viability of glioma cells

2.2 芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖采用EdU增殖染色法檢測(cè)不同處理對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響，如圖2A所示，圖中藍(lán)色的細(xì)胞（Hoechst 33342）代表所有細(xì)胞的細(xì)胞核，紅色的細(xì)胞（EdU）代表增殖細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比，芍藥苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和兩藥聯(lián)合組（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）均能抑制原代腦膠質(zhì)瘤的增殖能力（P ＜0.05）。與芍藥苷和替莫唑胺單藥相比較，兩藥聯(lián)合對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)（P ＜0.05）。EdU染色結(jié)果與MTS結(jié)果一致，提示芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制原代腦膠質(zhì)瘤膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

2.3 芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移分別用不同處理原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞16 h后，采用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，如圖2C所示，對(duì)照組、芍藥苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和兩藥聯(lián)合組（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）每視野的遷移細(xì)胞數(shù)分別為196.7 ± 14.5、98.0 ± 11.5、65.0±14.5、43.6±6.02個(gè)。芍藥苷、替莫唑胺和兩藥聯(lián)合組均能抑制原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力（P ＜0.05）；與芍藥苷和替莫唑胺單藥相比較，兩藥聯(lián)合對(duì)原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移抑制作用更強(qiáng)（P ＜0.05）。

圖2 芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移Fig.2 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the proliferation and migration of glioma cells

2.4 反向藥效團(tuán)對(duì)接技術(shù)提示Src 是芍藥苷治療膠質(zhì)瘤的潛在作用靶點(diǎn)以Norm Fit大于0.95作為判定標(biāo)準(zhǔn)篩選反向?qū)咏Y(jié)果，共對(duì)接出能與芍藥苷結(jié)合的62個(gè)潛在靶點(diǎn)。進(jìn)一步排除非膠質(zhì)瘤相關(guān)的作用靶點(diǎn)，最終獲得包括Src激酶在內(nèi)的潛在靶點(diǎn)32個(gè)。然后通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析這些潛在靶點(diǎn)的相互作用，結(jié)果如圖3所示，Src蛋白處于較為靶點(diǎn)蛋白相互作用較為核心的位置。

圖3 芍藥苷治療膠質(zhì)瘤潛在作用靶點(diǎn)相互作用Fig.3 The interaction of potential targets of paeoniflorin in the treatment of glioma

2.5 芍藥苷通過抑制Src/STAT3 信號(hào)通路協(xié)同替莫唑胺抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移采用Western blot檢測(cè)Src/STAT3信號(hào)通路的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比較，芍藥苷組（25 μmol/L）與替莫唑胺組（100 μmol/L）均能夠抑制增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、c-Myc以及遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)。與替莫唑胺組相比較，芍藥苷組顯著抑制p-Src和p-STAT3的表達(dá)。兩藥聯(lián)用（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）能夠顯著抑制Src/STAT3信號(hào)通路的激活，并增強(qiáng)對(duì)Src/STAT3信號(hào)通路下游增殖以及遷移相關(guān)蛋白的抑制作用。

圖4 芍藥苷協(xié)同替莫唑胺對(duì)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞Src/STAT3 信號(hào)通路的影響Fig.4 Paeoniflorin united temozolomide inhibits Src/STAT3 signaling pathway in glioma cells

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）最常見的原發(fā)惡 性腫瘤，年發(fā)病率為5/10萬(wàn)左右，多發(fā)于神經(jīng)外胚層，約占顱內(nèi)腫瘤的40%-50%，具有治愈率低、復(fù)發(fā)率高和病死率高的特點(diǎn)，患者預(yù)后不良［5］。目前對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療手段集中在手術(shù)、放療與化療三個(gè)方面，但腦膠質(zhì)瘤的治療效果仍不理想［6］。腦膠質(zhì)瘤治療中，化療藥物的耐藥是腦膠質(zhì)瘤治療失敗的主要原因之一，傳統(tǒng)的藥物如卡莫司汀、順鉑、替尼泊苷等臨床實(shí)際有效率僅20%左右［7］。

替莫唑胺是現(xiàn)今膠質(zhì)瘤化療的首選藥物。替莫唑胺為咪唑并四嗪類新型烷化劑，具有抗膠質(zhì)瘤活性，并自上市以來(lái)已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于臨床膠質(zhì)瘤治療［8-10］。國(guó)內(nèi)外大型臨床試驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)替莫唑胺治療后，腦膠質(zhì)瘤患者的平均存活期為13 ～32個(gè)月，明顯提高了生活質(zhì)量，使用者的腦水腫癥狀得到減輕，腦腫瘤體積減小，而且未見因嚴(yán)重不良反應(yīng)而終止治療的報(bào)道［11］。歐洲癌癥研究與治療組織和加拿大國(guó)家癌癥研究所臨床試驗(yàn)小組進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)Ⅲ期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的放療相比，放療基礎(chǔ)上聯(lián)合替莫唑胺治療可改善膠質(zhì)瘤患者的生存率［12］。另一項(xiàng)研究在老年（＞65歲）膠母細(xì)胞瘤患者中，短程放療聯(lián)合替莫唑胺，與單獨(dú)短程放療相比，能顯著延長(zhǎng)患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期［13］。盡管替莫唑胺顯示出一定的效果，但臨床上還存在著一定的局限性［14］。因此，有必要探討和研究聯(lián)合用藥以提高療效。

芍藥苷是一種水溶性單萜類糖苷化合物，普遍存在于毛茛科科植物中，是中藥赤芍、白芍和牡丹的主要有效成分。芍藥苷于1963年首次從芍藥中提取，化學(xué)分子式為C23H28O11，分子量為480.50［15］。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有多種藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗血小板聚集以及抗炎等。芍藥苷對(duì)多種腫瘤/癌癥（如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和白血?。┚哂辛己玫目鼓[瘤活性［16-17］。芍藥苷能夠通過抑制U87、U251、T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)［18-20］。芍藥苷通過抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的HGF/c-Met/RhoA/ROCK信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞遷移和侵襲以及肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重排［21］。芍藥苷能通過抑制S-期相關(guān)蛋白2的表達(dá)而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的作用［22］。芍藥苷通過microRNA-16上調(diào)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9下調(diào)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡［23］。除了單獨(dú)作用抑制腫瘤細(xì)胞外，研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能夠協(xié)同多種抗腫瘤藥物抑制腫瘤。芍藥苷能夠協(xié)同順鉑促進(jìn)caspase蛋白活性，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，抑制膀胱癌細(xì)胞體內(nèi)的生長(zhǎng)，并能減少順鉑治療導(dǎo)致的小鼠體重下降［24］。芍藥苷能夠通過抑制核內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)，協(xié)同奧沙利鉑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［25］。本研究對(duì)芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤作用進(jìn)行研究，MTS結(jié)果顯示芍藥苷聯(lián)合替莫唑胺可明顯抑制原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其作用呈時(shí)間和劑量依賴性。進(jìn)一步等效線圖分析顯示，芍藥苷聯(lián)合替莫唑胺的CI值明顯小于1，結(jié)合EdU染色結(jié)果，進(jìn)一步提示芍藥苷協(xié)同替莫唑胺能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示，芍藥苷協(xié)同替莫唑胺顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。以上結(jié)果提示芍藥苷能夠有效地協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移，提高替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用并降低其給藥濃度。

為了探索芍藥苷協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與遷移的作用機(jī)制，本研究采用反向藥效團(tuán)對(duì)接技術(shù)尋找能與芍藥苷發(fā)生結(jié)合的潛在蛋白。反向藥效團(tuán)對(duì)接技術(shù)是根據(jù)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)尋找靶蛋白的技術(shù)，能夠?yàn)樗幚砘钚詫?shí)驗(yàn)篩選靶蛋白，極大地提高對(duì)中藥有效成分的作用機(jī)制研究的效率［26］。芍藥苷的對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)了包括Src在內(nèi)的32個(gè)潛在靶點(diǎn)。Src是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，是由原癌基因c-Src編碼的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為60 kd的蛋白質(zhì)。Src廣泛存在于組織細(xì)胞中，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系［27］。既往研究發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中Src的磷酸化水平顯著升高，同樣地多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（T98G和U87）中也能觀察到Src活性升高［28-30］。使用siRNA阻斷Src能夠增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞毒性作用，抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和增殖［31］。作為一種非受體酪氨酸激酶，活化的Src能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）［32］。激 活 后 的STAT3與Src同源蛋白2結(jié)構(gòu)域相互作用而發(fā)生二聚化，產(chǎn)生的胞質(zhì)同源二聚體和異源二聚體并易位至細(xì)胞核，調(diào)控包括增殖、抗凋亡、遷移、侵襲與血管新生在內(nèi)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［33］。使用STAT3抑制劑能夠抑制抑制STAT3下游Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖和遷移，抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)［34］。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有抑制Src/STAT3信號(hào)通路作用，能夠顯著抑制p-Src以及p-STAT3的表達(dá)水平，與替莫唑胺聯(lián)用能夠進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)增強(qiáng)對(duì)Src/STAT3信號(hào)通路下游增殖相關(guān)靶蛋白CyclinD1和c-Myc以及遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的抑制，增強(qiáng)抑制原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明芍藥苷通過抑制Src/STAT3信號(hào)通路，協(xié)同替莫唑胺抑制原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，為芍藥苷聯(lián)合替莫唑胺藥物組合應(yīng)用于治療腦膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。