2個枸杞品種的蛋白質(zhì)提取與鑒定

張海燕，徐 煒，張立剛

（蘭州新區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院有限公司，甘肅 蘭州 730300）

枸杞（Lycium barbarum）為茄科枸杞屬，別名枸杞菜、紅珠仔刺、牛右力、狗牙子、狗牙根、狗奶子，多分枝灌木，果實呈橢圓形或圓柱形，枸杞一般喜光照［1］。近年來，枸杞作為藥食兼用的名貴資源已為國內(nèi)外學(xué)者所矚目，特別是國內(nèi)許多學(xué)者對枸杞的化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)以及功能評價等方面進行了許多卓有成效的研究，并用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和化學(xué)方法研究了枸杞的化學(xué)成分及功能因子，尤其對枸杞多糖的提取分離、化學(xué)分析、藥理作用及臨床應(yīng)用已具有較廣泛的研究基礎(chǔ)［2-3］。研究較多的另一大類活性物質(zhì)為類胡蘿卜素，還有核黃素、維生素C、維生素B1、尼克酸、?；撬?、17種氨基酸以及銅、鐵、鋅、錳、鎂、硒、鈣等多種微量元素，這些研究表明枸杞不僅營養(yǎng)豐富而且確實具有多方面的保健功能［4-5］。蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體各組分的重要物質(zhì)，枸杞中微量蛋白質(zhì)也在枸杞功能中發(fā)揮著重要的作用，但與之相關(guān)的報道相對較少。寧杞1號為寧夏農(nóng)林科學(xué)院從中寧農(nóng)家品種大麻葉中采用單株選優(yōu)方法選育而成［6］，是我國枸杞的主栽品種。蒙杞1號由內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院園藝研究所同內(nèi)蒙古河套大學(xué)合作選育而成，有寸杞之稱，和寧杞1號（地產(chǎn)）相比果實體積增大1倍以上，特優(yōu)級果率增加73%，果肉厚度增大28%，果實千粒重增加 994.9 g［7］。

我們采用鹽析、透析等方法，對蒙杞1號和寧杞1號中蛋白質(zhì)進行提取，并利用蛋白質(zhì)的SDS凝膠電泳技術(shù)測定2個枸杞中蛋白質(zhì)的含量以及分析其電泳行為［8］，對枸杞中的蛋白質(zhì)進行分析，以探索蛋白質(zhì)含量與枸杞品質(zhì)的關(guān)系，為枸杞品質(zhì)鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試枸杞品種蒙杞1號由內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院園藝研究所提供，寧杞1號由寧夏農(nóng)林科學(xué)院提供。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，營養(yǎng)果蔬破壁養(yǎng)生機，海爾電冰箱，電子天平，TGL-16M高速低溫冷凍離心機（湘儀），超純水系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，SHZ-88水浴恒溫振蕩器，多功能電磁爐，電泳儀，電泳槽，格蘭仕微波爐。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取 將種子洗凈晾干，稱取蒙杞1號、寧杞1號各60 g，用破壁打漿機制漿，用紗布粗過濾，得到濾液。

1.3.2 鹽析 鹽析是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程，蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，其表面大部分是親水基團，內(nèi)部大部分是疏水基團。量取制漿后的枸杞液20 mL，分別根據(jù)體積計算出對應(yīng)pH下的（NH4）2SO4量，如pH 6.0時，向其中加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質(zhì)溶液的（NH4）2SO4飽和度達40%，搖勻，再靜置2～3 h后6 000 r/min離心20 min，傾出上清液并向其中繼續(xù)加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質(zhì)溶液的飽和度達60%，搖勻，再靜置2～3 h后以8 000 r/min離心20 min，傾出上清液并向其中繼續(xù)加入（NH4）2SO4固體，使蛋白質(zhì)溶液的飽和度達80%，搖勻，再靜置2～3 h后以8 000 r/min離心20 min棄去上清液。向3次離心后傾出上清液的離心管中加入0.02 mol/L pH 6.0的PBS緩沖液5 mL，輕輕搖動，使貼于管壁上的蛋白質(zhì)溶解后置冰箱中保存。用同樣的方法對pH分別為7.0和8.0的枸杞蛋白提取液進行分級鹽析，最后制得Ma1（6.0，40%）、Ma2（6.0，60%）、Ma3（6.0，80%）、Mb1（7.0，40%）、Mb2（7.0，60%）、Mb3（7.0，80%）、Mc1（8.0，40%）、Mc2（8.0，60%）、Mc3（8.0，80%）9個蒙杞 1號蛋白樣液。用同樣的方法得到Na1（6.0，40%）、Na2（6.0，60%）、Na3（6.0，80%）、Nb1（7.0，40%）、Nb2（7.0，60%）、Nb3（7.0，80%）、Nc1（8.0，40%）、Nc2（8.0，60%）、Nc3（8.0，80%）9個寧杞1號蛋白質(zhì)樣液。

1.3.3 透析 將2種蛋白質(zhì)提取液分別裝入透析袋中，置于對應(yīng)pH的0.02 mol/L PBS緩沖液中進行透析，每隔6～8 h換PBS緩沖液1次，連續(xù)透析64 h。

1.3.4 濃縮 將裝有蛋白質(zhì)樣液的透析袋置于盛有聚乙二醇的培養(yǎng)皿中濃縮，直到蛋白質(zhì)樣液體積為1 mL左右為止。

1.3.5 蛋白質(zhì)的鑒定 將枸杞蛋白質(zhì)與樣品緩沖液按體積比1∶1混合，加熱煮沸3 min，10 000 r/min離心，分離膠和濃縮膠的制備方法見表1［10］，然后進行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）［9］、染色和脫色Ⅳ［11］，最后照相。

表1 分離膠和濃縮膠的制備方法

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙杞1號電泳后條帶分布情況

由蒙杞1號蛋白質(zhì)電泳圖譜（圖1）中條帶的寬度和顏色深度不一可知，每種蛋白的含量不同。在相同pH條件下，（NH4）2SO4濃度為40%時條帶顏色最深，（NH4）2SO4濃度為60%、80%時依次降低，（NH4）2SO4濃度為80%時幾乎沒有條帶。在相同（NH4）2SO4濃度下，pH為8時蛋白質(zhì)條帶顏色最深。且每個泳道蛋白質(zhì)條帶數(shù)不同，說明在不同條件下枸杞中蛋白質(zhì)含量不同。

2.2 寧杞1號電泳后條帶分布情況

由圖2條帶的寬度和顏色的深淺不一可知，每種蛋白的含量不同。在相同pH下，（NH4）2SO4濃度為60%時蛋白質(zhì)條帶顏色最深，（NH4）2SO4濃度為80%時幾乎沒有蛋白質(zhì)條帶。在相同（NH4）2SO4濃度下，pH為6時蛋白質(zhì)條帶最多；pH為7、8時蛋白質(zhì)含量依次降低；pH為8時幾乎沒有蛋白質(zhì)條帶。

2.3 2個品種電泳后分析

蒙杞1號在Na1（6.0，40%）的條件下，有蛋白質(zhì)亞基7種；而寧杞1號在Na1（6.0，40%）即相同條件下，蛋白質(zhì)亞基數(shù)為5。其余在相同條件下，除（NH4）2SO4濃度為80%外，蒙杞1號中蛋白質(zhì)亞基數(shù)多于寧杞1號中蛋白質(zhì)的亞基數(shù)。蒙杞1號在Ma1（6.0，40%）和 Mc2（8.0，60%）條件下蛋白質(zhì)亞基數(shù)均為7，pH為8時蛋白質(zhì)亞基數(shù)為0；寧杞 1 號在 Na1（6.0，40%）和Nb1（7.0，40%）條件下，蛋白質(zhì)亞基數(shù)均為5，pH為8時蛋白質(zhì)亞基數(shù)也為0。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，枸杞中存在一定量的蛋白質(zhì)。蒙杞1號中的蛋白質(zhì)亞基多于寧杞1號。相同硫酸銨濃度，不同pH下，蛋白質(zhì)亞基數(shù)不同。蒙杞1號在pH 6.0時蛋白質(zhì)亞基數(shù)最多，即含量最多；pH 7.0、8.0時蛋白質(zhì)亞基數(shù)依次減少，其中pH 8.0時幾乎沒有蛋白質(zhì)，亞基數(shù)為0。寧杞1號在pH 7.0時蛋白質(zhì)亞基數(shù)最多，蛋白質(zhì)含量最多；pH 6.0時亞基數(shù)減少，蛋白質(zhì)含量降低；pH 8.0時幾乎沒有蛋白質(zhì)。在相同pH、不同硫酸銨濃度下，亞基數(shù)不同，即蛋白質(zhì)含量不同。蒙杞1號在硫酸銨鹽濃度為40%時亞基數(shù)最多，蛋白質(zhì)含量最多；硫酸銨鹽濃度為80%時蛋白質(zhì)含量最少，亞基數(shù)為0。寧杞1號在硫酸銨鹽濃度為80%時蛋白質(zhì)含量最少，幾乎沒有蛋白質(zhì)；濃度在60%時相對較多，40%時亞基數(shù)最多，蛋白質(zhì)含量最高。綜上可知，蒙杞1號在pH 6.0、硫酸銨鹽濃度為40%時提取效果最好，寧杞1號在pH 7.0、硫酸銨鹽濃度為60%時提取效果最佳。