中草藥飼料添加劑對梅花鹿血清免疫球蛋白和免疫機能影響的研究

田來明，田 鑫，崔鶴馨，權心嬌，李 男，付曉霞

長春市農業(yè)科學院，吉林長春 130000

中草藥飼料添加劑能夠向動物體內的微生物菌群提供營養(yǎng)底物，以此來改善胃腸環(huán)境和菌群結構，進而調控胃腸發(fā)酵、減少乳酸鹽的產生、穩(wěn)定pH值，促進整個腸道乳酸利用菌、纖維素菌等有益菌的繁殖，提高其濃度及活力，從而促進動物對營養(yǎng)物質的消化、吸收和利用、增加采食量、改善飼料利用率、提高生產性能；中草藥飼料添加劑也可影響動物的免疫系統(tǒng)，其能夠抑制和吸附腸道內病原菌并能夠調節(jié)非特異免疫防御機制，同時能夠很好的防止毒素吸收，阻止病原性微生物及毒素在胃腸黏膜表面上的附著，同時可刺激機體產生特異性免疫,形成免疫防御機制；中草藥飼料添加劑不僅可激發(fā)、增強機體的免疫力和抗病力，還可維護胃腸道微生態(tài)平衡、選擇性促進胃腸道有益菌群增殖,還可抑制有害菌的繁殖。中草藥飼料添加劑最初在反芻動物中應用是用做補充飼料。隨著食品安全性的提高和人們對綠色安全性食品的追求，中草藥飼料添加劑因其無毒、無殘留、無污染且不產生耐藥性等優(yōu)點，在畜牧業(yè)生產中得到廣泛應用。本試驗主要是應用中草藥飼料添加劑在梅花鹿生產中應用，研究其對梅花鹿免疫機能的影響。

1 材料與方法

1.1 梅花鹿要求

選擇體況、體重相近，體質外貌、遺傳相近、出生日期相同或相近，健康的公鹿32頭。

1.2 試驗時間和地點

試驗于2018年8月10日～2019年8月10日在吉林省長春市某試驗鹿場基地進行。

1.3 試驗儀器、藥品及試劑

中草藥飼料添加劑：板藍根、淫羊藿、黨參、黃芪、白術，比例為2:1:2:2:2；Array360特種蛋白分析儀；流式細胞儀；PBS等。

1.4 試驗設計

采用單因子試驗設計，用不同中草藥飼料添加劑比例進行飼喂。將32頭3歲齡梅花鹿隨機分成4個組：A、B、C、D、每組8頭，A組作為對照組，飼喂不添加中草藥飼料添加劑的全價飼料，B、C、D組分別喂3個不同中草藥飼料添加劑梯度的全價飼料，B組0.1%（占基礎日糧比重），C組0.2%，D組0.5%。每組除中草藥飼料添加劑的添加水平不同，其他水平日糧基本相同?；A日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 梅花鹿公鹿日糧配方及成分比

1.5 飼養(yǎng)管理

按鹿場常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進行，預試期3 d，同時進行消毒、預防接種、驅蟲等。試驗鹿每日投喂3次，鹿只自由飲水,每日注意觀察采食情況，按鹿場正常程序進行免疫，試驗期5個月。

1.6 指標測定及方法

試驗前2～3 天,采集試驗組及對照組的梅花鹿血液,然后連續(xù)投喂中草藥飼料添加劑,在二茬茸生長結束時停止飼喂。這期間應分別采集頭茬茸和二茬茸的血液。將一部分血液用EDTA凝裝于試管中,用于檢測T、B細胞,另一部分應為不抗凝,用于免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的測定。采集后立即送往實驗室，4 000 r/min離心10 min，收集血清于1.5 mLEP管中，-20 ℃低溫保存，待測，每組采血樣各3份。

1.6.1血清生化指標測定

試驗對梅花鹿生茸前期、生茸期及再生茸時期的血清中免疫球蛋白IgA、IgG、lgM進行了測定,從而研究中草藥飼料添加劑對免疫球蛋白IgA、lgG、IgM的影響。應用Array360特種蛋白分析儀器測定，其原理是在特殊緩沖液中抗原抗體快速形成抗原抗體復合物,使反應液濁度。在反應液中要求抗體必須過剩,使其形成抗原抗體復合物隨抗原量增加而增加,所以反應液的濁度也將增加,然后標準品對照分析,即可計算出未知蛋白的含量。

1.6.2 淋巴細胞的檢測

利用流式細胞術檢測T、B淋巴細胞的含量。

1.6.2.1 淋巴細胞懸液的制備

采集茸血2 mL,經EDTA抗凝,加入0.85%Nacl溶液5 mL。將淋巴細胞分離液2 mL,置于錐形離心管中,取1～1.5 mL全血混懸液加入淋巴細胞分離液上層,8 000r/min離心15 min。取淋巴細胞層,加入PBS4 mL混勻洗滌,l 000 r/min離心10 min,棄上清液,重復一次后,加入0.5 mLPBS緩沖液混勻,此液為單淋巴細胞懸液。

1.6.2.2 免疫熒光標記

取50 μL單淋巴細胞懸液，加入50 μL標有熒光素的犬抗鼠單克隆抗體液,1 000 r/min離心，棄上清液,加入50 μLFITC-犬抗鼠IgG液,37 ℃水溶避光，加入2 mLPBS混勻,離心10 min,棄上清液,重復一次后加入1 mLPBS緩沖液混勻。

1.6.2.3 檢測

用FACS440型流式細胞儀上機檢測。

1.7 統(tǒng)計方法

采用spss19.0軟件進行分析，所得結果以平均值±標準差表示，其中p＞0.05為差異不顯著，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 中草藥對血清免疫球蛋白的影響

表1 生茸前期血清免疫球蛋白含量變化 μg/mL

試驗組B、C、D及對照組的血清免疫球蛋白含量，運用單因子方差分析及Duncan多重比較，IgA、IgG、lgM各組間差異不顯著（p＞0.05）。

表2 頭茬茸試驗組與對照組血清免疫球蛋白的含量

試驗組B、C、D及對照組的血清免疫球蛋白含量，IgA值D與C組間比較IgA值差異不顯著（p＞0.05），D、C組與B和A組間比較差異顯著（p＜0.05），B與A組間比較值差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組IgA值明顯高于對照組A。IgG值B與C組間比較IgG值差異不顯著（p＞0.05），B與C組和D與A間比較IgG值差異顯著（p＜0.05），D與A間比較IgG值差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組明顯高于對照組A。lgM值D與C組間比較lgM值差異不顯著（p＞0.05），D與A、B組間比較lgM值異顯著（p＜0.05），C與A、B組間比較lgM值異顯著（p＜0.05）, A與B組間比較異顯著（p＜0.05）。

表3 二茬茸試驗組與對照組血清免疫球蛋白的含量a

試驗組B、C、D及對照組的血清免疫球蛋白含量，IgA值D與B組間比較IgA值差異不顯著（p＞0.05），D、B組與C和A組間比較差異顯著（p＜0.05），A與C組間比較IgA值差異顯著（p＜0.05）。IgG值D與B組間比較差異不顯著（p＞0.05），D、B組與C和A組間比較IgG值差異顯著（p＜0.05），A與C組間比較IgG值差異顯著（p＜0.05）。IgM值B與C組間比較lgM值差異不顯著（p＞0.05），D與A組間比較差異顯著（p＜0.05）。

2.2 中草藥飼料添加劑對血漿T、B淋巴細胞含量的影響

2.2.1 生茸前期試驗組與對照組血漿T、B淋巴細胞的含量

對于試驗組B、C、D及對照組A的Cd3（T）、Cd19（B）值,運用單因子方差分析,p＞0.05,說明試驗組B、C、D及對照組A的（Cd3）各組間差異不顯著，p＜0.05，說明各組間差異顯著，本試驗生茸前期試驗組與對照組血漿T、B淋巴細胞的含量差異不顯著。

2.2.2 與對照組血漿T、B淋巴細胞的含量

表4 生茸前期試驗組與對照組免疫細胞含量(x106/mL)

表5 頭茬茸試驗組與對照組免疫細胞含量(x106/mL)

頭茬茸T細胞試驗組與對照組相比差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組明顯高于A組，B組與C、D組相比差異顯著（p＜0.05），C與D組間差異不顯著（p＞0.05）；B細胞頭茬茸試驗組與對照組相比差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組明顯高于A組，B與C組間比較差異不顯著（p＞0.05），C與D組間差異也不顯著（p＞0.05），但B與D組間差異顯著。

2.2.3 二茬茸試驗組與對照組血漿T、B淋巴細胞的含量

表6 二茬茸試驗組與對照組免疫細胞含量(x106/mL)

T細胞二茬茸試驗組與對照組相比，A與B組差異不顯著（p＞0.05），D與C組比較差異不顯著（p＞0.05），但A與B組和D與C組相比差異顯著（p＜0.05）；B細胞與對照組相比差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組明顯高于A組，但B、D、C組間無顯著差異（p＞0.05）。

3 討論

中草藥飼料添加劑種類很多,生產上要注意中草藥類型的選擇。作為理想的中草藥添加劑應具備：①對動物和人具有一定的安全性，無健康危害；②適應外界環(huán)境如飼料加工過程中的熱、干燥、擠壓和振動等；③對消化道有益微生物的活性具有促進作用，能夠提高機體的免疫力等。

3.1 中草藥對梅花鹿血清蛋白影響

免疫系統(tǒng)有免疫器官、免疫細胞和免疫因子組成，抗體免疫球蛋白分為IgA、IgG、IgM等。本試驗僅對中草藥添加劑飼喂養(yǎng)后IgA、IgG、IgM免疫球蛋白在血清中的含量變化進行研究。

IgA是常規(guī)構造的免疫球蛋白，在動物體的外分泌中IgA是主要的免疫球蛋白,它在保護腸道、呼吸道和泌尿道等抵抗微生物的入侵方面有著極其的重要性。同時IgG是血清中的濃度最高的一類免疫球蛋白,在抗體介導的防御機制中起主要作用，有抗細菌、病毒、外毒素等多種活性；IgG能夠調理、凝集和沉淀抗原；IgM是免疫應答中的重要免疫球蛋白,在激活補體、調理作用、中和病毒等方面比IgG要有效得多。

試驗組與對照組各時期血清免疫球蛋白的含量比較見圖1。

圖1a 各試驗組與對照組IgA含量比較

圖1b 各試驗組與對照組IgG含量比較圖1c 各試驗組與對照組IgM含量比較

3.1.1 生茸前期試驗組與對照組免疫球蛋白的含量

本試驗研究結果，在生茸前期，血清IgA、IgG、IgM的含量各組間差異不顯著（p＞0.05）。

3.1.2 頭茬茸試驗組與對照組免疫球蛋白的含量及比較

頭茬茸時期，IgA、IgG、IgM的含量高于對照組，B、C、D組與對照組比較差異顯著（p＜0.05）；IgA的含量C組明顯高于其他各組，B、D組高于對照組，但B、D組間IgA的含量差異不顯著；IgG的含量B、C、D組高于對照組，各組間差異顯著（p＜0.05），B、C組間差異不顯著（p＞0.05），B、C組高于D組；IgM的含量B、C、D組高于對照組，差異顯著（p＜0.05），C、D組間差異不顯著（p＞0.05），CD組含量高于B組，且差異顯著（p＜0.05）。

3.1.3 免疫球蛋白的含量在二茬茸試驗組與對照組的比較

二茬茸時期，IgA、IgG、IgM的含量高于對照組，B、C、D組與對照組比較差異顯著（p＜0.05）。二茬茸時期，IgA、IgG、IgM的含量高于對照組，B、C、D組與對照組比較差異顯著（p＜0.05）。IgA的含量C組高于B、D組，差異顯著（p＜0.05），B、D組間比較差異不顯著（p＞0.05）；IgG的含量C組高于B、D組，差異顯著（p＜0.05），B、D組間比較差異不顯著（p＞0.05）；IgM的含量D組高于B、C兩組，差異顯著（p＜0.05），B、C組間比較差異不顯著（p＞0.05）。通過試驗可看出，在梅花鹿茸前期飼喂的中草藥添加劑，血清IgA、IgG、IgM的含量較對照組差異顯著(p＜0.05),可見中草藥飼料添加劑對IgA、IgG、IgM的含量有顯著的增加作用,它可以提高動物機體免疫功能。

3.2 中草藥飼料添加劑對血漿T、B淋巴細胞含量的影響

中草藥飼料添加劑含有豐富的營養(yǎng)物質,同時也可穩(wěn)定胃腸道微生物菌群平衡，保證動物纖維素和礦物質的消化能力,提高免疫力和吸附致病因子。動物機體T、B淋巴細胞是重要的免疫細胞,T、B細胞可反映動物機體免疫機能的強弱。試驗組與對照組血漿T、B淋巴細胞含量的比較見圖2。

圖2a 各試驗組與對照組血漿T淋巴細胞含量比較

圖2b 各試驗組與對照組血漿B淋巴細胞含量比較

3.2.1 生茸前期試驗組與對照組血漿T、B淋巴細胞的含量及比較

本試驗結果表明,飼料中沒有添加中草藥飼料添加劑的組，試驗組與對照組間的T、B淋巴細胞數量差異不顯著(p<0.05)。

3.2.2 頭茬茸和二茬茸血漿T、B淋巴細胞的含量及比較

試驗結果表明,頭茬茸血漿T淋巴細胞含量B、C、D試驗組高于對照組A, 各組與A組間比較差異顯著（p＜0.05）。T細胞二茬茸試驗組與對照組相比，A與B組差異不顯著（p＞0.05），D、C和A組比較差異顯著（p＜0.05）；二茬茸試驗組與對照組T細胞相比，A與B組差異不顯著（p＞0.05），D與C組差異不顯著（p＞0.05），但A與B組和D與C組差異顯著（p＜0.05）；B細胞二茬茸試驗組與對照組相比差異顯著（p＜0.05），B、C、D各組明顯高于A組，但B、D、C組間無顯著差異（p＞0.05）。通過對比可看出中草藥飼料添加劑同日糧共同飼喂梅花鹿可以提高梅花鹿T、B細胞含量，增加動物機體免疫功能，預防疾病的發(fā)生。應用中草藥技術開發(fā)的飼料添加劑具有提供營養(yǎng)和促進動物生長的作用,使其能夠成為一類優(yōu)質的飼料添加劑。隨著科技水平和加工技術的提高中草藥飼料添加劑的應用將會越來越受到人們的重視，并將在動物養(yǎng)殖過程中大放光彩。

參考文獻：略