表面活性劑雙水相萃取牛血清白蛋白的影響因素

王新剛，楊效益，孫永強(qiáng)，郭朝華，李 萍，李建波

（中國(guó)日用化學(xué)工業(yè)研究院有限公司，山西太原 030001）

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的生物分子，在許多生物工程方面起著至關(guān)重要的作用，例如在生物技術(shù)方面，蛋白質(zhì)在治療和診斷應(yīng)用中具有重要價(jià)值［1］。蛋白質(zhì)的功能取決于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但是有聚合物、鹽或者有機(jī)溶劑存在時(shí)［2-5］，或者在高溫高壓操作條件下［6-7］，又或者是在調(diào)節(jié)pH的過程［8］中，蛋白質(zhì)容易失去穩(wěn)定性而導(dǎo)致功能喪失。因此，開發(fā)低成本、可持續(xù)而且可以保證蛋白質(zhì)不變性的分離技術(shù)具有重要意義。蛋白質(zhì)分離的常用技術(shù)包括沉淀、過濾、基于反膠束的分離、凝膠色譜、電泳等［9-10］，但是這些傳統(tǒng)方法往往存在操作步驟繁瑣、蛋白質(zhì)產(chǎn)率低、需要大量有機(jī)溶劑等問題，致使不能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離的規(guī)模化。

高分子水溶液在合適條件（如加鹽）下會(huì)發(fā)生相分離，形成的相分離體系被稱為雙水相體系（ASTP）。蛋白質(zhì)等生物分子可以在平衡的兩相中都保持活性，但是在利用高分子雙水相體系萃取分離蛋白質(zhì)時(shí)卻難以實(shí)現(xiàn)高分子的回收利用［11］，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)成本較高。近年來(lái)，有相關(guān)研究報(bào)道，當(dāng)陰陽(yáng)離子表面活性劑在合適的濃度或以合適的比例混合時(shí)也會(huì)形成雙水相體系，并且可應(yīng)用于蛋白質(zhì)的萃取。與其他蛋白質(zhì)分離工藝相比，陰陽(yáng)離子表面活性劑形成的雙水相體系因溫度溫和、易于操作［12-13］、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和提取。

在探究窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（NAEnS，n=3，5，7，9）與陽(yáng)離子表面活性十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）復(fù)配體系的表面行為時(shí)發(fā)現(xiàn)，聚氧乙烯基團(tuán)（EO）加合數(shù)為5的窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（N-AE5S）與TTAB在復(fù)配過程中會(huì)形成雙水相體系。故本實(shí)驗(yàn)探究了N-AE5S/TTAB雙水相體系中陰陽(yáng)離子表面活性劑物質(zhì)的量比、表面活性劑濃度對(duì)牛血清白蛋白（BSA）萃取率的影響，同時(shí)對(duì)萃取機(jī)理進(jìn)行了初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

窄分布脂肪醇醚硫酸鈉（烷基鏈長(zhǎng)C12～14，實(shí)驗(yàn)室自制），十四烷基三甲基溴化銨（分析純）、牛血清白蛋白Ⅴ（98%）（阿拉丁化學(xué)試劑公司），實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器

UV-1601紫外-可見分光光度儀（中國(guó)北分瑞利分析儀器有限公司），JEM-1011透射電子顯微鏡（日本JEOL公司），Zetasizer Nano-ZS90粒度電位儀（英國(guó)Malvern公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制不同質(zhì)量濃度的BSA溶液，利用紫外-可見分光光度儀分別測(cè)定278 nm處的吸光度（以水為參比），并根據(jù)相應(yīng)質(zhì)量濃度下的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 測(cè)試

1.4.1 萃取率

配制N-AE5S/TTAB混合溶液（其中BSA質(zhì)量濃度固定在1 mg/mL），于25 ℃下靜置72 h。同時(shí)為了避免其他因素的干擾，在相同條件下做空白實(shí)驗(yàn)。待分層穩(wěn)定后將萃取液和空白樣上層表面活性劑富集相稀釋50倍，以空白樣為參比測(cè)試在278 nm處的吸光度。根據(jù)下式計(jì)算萃取率：

其中，Vu和ρu分別是雙水相上層表面活性劑富集相的體積和BSA質(zhì)量濃度，V和ρ分別是萃取體系的總體積和BSA質(zhì)量濃度。

1.4.2 Zeta電位

配制0.1 mol/L N-AE5S/TTAB混合溶液，于25 ℃下靜置72 h，待分層穩(wěn)定后利用粒度電位儀測(cè)定其上層表面活性劑富集相的電勢(shì)。

1.4.3 聚集形貌

將N-AE5S/TTAB溶液（物質(zhì)的量比4.2∶5.8）快速混勻后，于25 ℃下靜置72 h，待分層穩(wěn)定后取上層表面活性劑富集相，利用磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色，24 h后利用透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相區(qū)域的確定

將0.1 mol/L N-AE5S溶液與TTAB溶液按照不同物質(zhì)的量比混合配成總濃度為0.1 mol/L的混合溶液，快速混勻后于25 ℃下靜置72 h，待分層穩(wěn)定后采用逐滴加水法確定N-AE5S/TTAB混合溶液雙水相形成的區(qū)域，結(jié)果如圖1所示。

圖1 N-AE5S/TTAB混合溶液在25 ℃下的相圖

由圖1可以看出，N-AE5S/TTAB混合溶液在物質(zhì)的量比為3.8∶6.2～5.5∶4.5時(shí)均能形成ASTP，而且ASTP主要集中于陰離子表面活性劑N-AE5S過量區(qū)，只有一小部分存在于較高混合溶液濃度的陽(yáng)離子表面活性劑TTAB過量區(qū)。同時(shí)，當(dāng)N-AE5S/TTAB物質(zhì)的量比為4.4∶5.6時(shí)，將混合溶液稀釋至7.79×10-3mol/L仍然能夠形成ASTP。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖2a所示，BSA在278 nm處存在較強(qiáng)的吸收峰，故將波長(zhǎng)固定在278 nm，測(cè)定不同質(zhì)量濃度BSA溶液的吸光度，然后根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2b所示。

圖2 0.6 mg/mL BSA溶液的紫外光譜圖(a)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)

2.3 N-AE5S/TTAB雙水相體系對(duì)BSA萃取率的影響

2.3.1 表面活性劑濃度

如圖3所示，隨著表面活性劑混合溶液總濃度的增大，萃取率逐漸降低。Asenjo等［14］指出，隨著萃取劑分子質(zhì)量的增大，萃取率逐漸降低。

圖3 N-AE5S/TTAB混合溶液濃度-萃取率關(guān)系圖

如圖4所示，隨著濃度的增大，ASTP上層表面活性劑富集相中的聚集體從球形聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)在一起且體積較大的網(wǎng)狀聚集結(jié)構(gòu)。N-AE5S/TTAB混合溶液聚集體間的進(jìn)一步聚集致使分子質(zhì)量增大，萃取率逐漸降低。

圖4 N-AE5S/TTAB混合溶液上層表面活性劑富集相的聚集形貌

2.3.2 N-AE5S/TTAB物質(zhì)的量比

如圖5所示，隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例逐漸增大，萃取率逐漸降低直至為0%。當(dāng)表面活性劑濃度為6.0×10-2mol/L、物質(zhì)的量比為4.2∶5.8時(shí)，N-AE5S/TTAB混合溶液形成的ASTP對(duì)BSA的萃取率達(dá)66.05%。與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)萃取工藝相比，該萃取體系中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%，可以減少萃取溶劑的使用量，降低了萃取成本。

圖5 N-AE5S/TTAB物質(zhì)的量比-萃取率關(guān)系圖

隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例的增大，混合溶液上層表面活性劑富集相的電勢(shì)逐漸降低，并從正值轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值。而BSA的等電點(diǎn)為4.7［15］，萃取體系的pH為7，所以BSA在N-AE5S/TTAB混合溶液中顯負(fù)電性。結(jié)合圖6可知，在N-AE5S/TTAB混合溶液中形成的聚集體通過靜電相互作用與BSA結(jié)合在一起，而隨著N-AE5S在混合溶液中所占比例的逐漸增大，聚集體的正電性減弱，其與BSA間的靜電相互作用減弱，導(dǎo)致N-AE5S/TTAB混合溶液對(duì)BSA的萃取率逐漸降低。

圖6 N-AE5S/TTAB混合溶液萃取BSA上層表面活性劑富集相的聚集形貌

3 結(jié)論

（1）N-AE5S/TTAB混合溶液濃度固定在0.1 mol/L時(shí)，可以在物質(zhì)的量比3.8∶6.2～5.5∶4.5內(nèi)形成ASTP，且ASTP主要集中于N-AE5S過量區(qū)。

（2）當(dāng)物質(zhì)的量比固定時(shí)，隨著N-AE5S/TTAB混合溶液濃度的增加，ASTP中聚集體進(jìn)一步聚集為較大的聚集體，致使BSA萃取率逐漸降低。

（3）當(dāng)表面活性劑濃度固定時(shí)，隨著N-AE5S在N-AE5S/TTAB混合溶液中所占比例的增加，聚集體的正電性逐漸降低，致使其與BSA的靜電相互作用減弱，對(duì)BSA的萃取率逐漸降低。

（4）在濃度為6.0×10-2mol/L、N-AE5S/TTAB物質(zhì)的量比為4.2∶5.8時(shí)，ASTP對(duì)BSA的萃取率達(dá)66.05%（以水為參比時(shí)，萃取率為92.85%）。