Livin 在彌漫大B 細胞淋巴瘤的表達及其臨床意義

易滬萍 ，張福楊 ，劉謙 ，羅小江

（江西省人民醫(yī)院,1.普外科；2.病理科，南昌 330006）

彌漫性大 B 細胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL) 是一種高度異質(zhì)性的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤， 是成人非霍奇金惡性淋巴瘤最常見的類型之一。據(jù)報道，歐美國家非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL) 中 30%為 DLBCL， 而在我國，DLBCL 發(fā)病率高達 40%[1,2]。 由于 DLBCL 的臨床和生物學(xué)異質(zhì)性,許多學(xué)者致力于研究有效的生物標(biāo)志物來預(yù)測預(yù)后和幫助患者的臨床管理[3]。

Livin 是抗凋亡蛋白中的一員， 通過抑制蛋白的活性而阻止凋亡進程[4]。近年來，越來越多與DL BCL 相關(guān)免疫標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，研究表明 Livin 蛋白在彌漫大B 細胞淋巴瘤中表達水平增加[5]，然而其表達與 DLBCL 患者生存期的關(guān)系有待進一步研究。 本研究旨在分析 Livin 的表達與彌漫性大 B細胞淋巴瘤臨床病理特征、 疾病進展及患者預(yù)后的關(guān)系， 為臨床治療方案的確定和預(yù)后的判斷提供實用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集江西省人民醫(yī)院病理科2012年1 月 至 2013 年6 月間首次診斷為DLBCL 的石蠟包埋標(biāo)本80 例,利用免疫組織化學(xué)法檢測Livin蛋白在DLBCL 中的表達情況,聯(lián)合檢測 CDl0、bcl-6、MUM-l 進行 Hans 法分型[2]，由 2 位資深病理醫(yī)師根據(jù)腫瘤組織學(xué)特征和免疫表型綜合分析并明確診斷。 全部研究對象符合世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2016 年造血和淋巴組織腫瘤修訂版分類的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。 最終納人研究80例（“雙打擊”或“三打擊”高級別 B 細胞淋巴瘤病例未納入本研究對象），所有患者均未經(jīng)任何治療、有完整的臨床和病理資料。本次研究所有標(biāo)本均獲得患者本人或者家屬知情及同意，同時經(jīng)江西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意其實施?；颊吣挲g32-80 歲，中位年齡 52 歲，＜60 歲者 32 例，≥60 歲者48 例。 男 46 例，女 34 例。 病變部位：淺表淋巴結(jié)43 例，胃腸道 18 例，腸系膜 9 例，脾 2 例，扁桃體 8 例。 其中，28 例患者有 B 癥狀，52 例無 B 癥狀。 有結(jié)外癥狀者 55 例， 無結(jié)外癥狀者 25 例。DLBCL 組中，根據(jù) Ann Arbor 分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，53 例患者臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期，27 例為Ⅲ、Ⅳ期；38 例患者淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù) （international prognostic index，IPI）＜2 分 ， 42 例 患 者 IPI ≥2 分 。 根 據(jù)Hans 法分型顯示非生發(fā)中心B 細胞樣亞型（nongerminal centre B-cell-like，non-GCB 型）58 例,生發(fā)中心 B 細胞樣亞型 （germinal centre B-celllike，GCB 型）22 例。

1.2 方法

1.2.1 所用試劑 濃縮型 Livin 兔抗人多克隆抗體購于 Abcam（香港）公司；一抗 CD20、PAX-5、CD3、CD5、CD30（Ber-H2） 、Bcl-2（SP66）、C-myc（Y69）、CD10 （56C6）、 Bcl-6 （LN22）、MUM-1（MUM1p）、CD5 （SP19）、CD138 （MI15）、LMP-1（CS1）、CD21（EP64）、EDTA 抗 原 修 復(fù) 液 、 二 硝 基 聯(lián) 苯 胺（DAB）及即用型二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或兔IgG 聚合物）均購于邁新生物公司。

1.2.2 組織芯片 首先制作 2.5cm×2.0cm×0.5cm 大小的空白蠟塊 2 個，設(shè)計 1 個 5×8 點、1 個 5×9 點組織微陣列。 根據(jù) DLBCL 的 HE 切片，每例選定1 個典型的腫瘤取樣位點；用自制的穿刺針將所選定的組織穿刺取出(直徑 3 mm)，并植人預(yù)先制備的“受體”蠟塊中，起始端空兩孔作為標(biāo)記，并畫圖記錄病理號，3um 厚連續(xù)切片，烤片后根據(jù)抗體說明做免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 免疫組化 免疫組化采用 EnVision 兩步法，石蠟切片厚度 4μm，經(jīng)脫蠟至水后，3% H2O2孵育10min 除去內(nèi)源性過氧化物酶。 用 pH=7.2-7.4 的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，3min/次， 根據(jù)不同抗體說明選用不同 PH 值EDTA 修復(fù)液或濃度為 0.01mol/L、pH=6.0 的檸檬酸緩沖液高壓熱修復(fù)，待修復(fù)液降至室溫甩干，滴加一抗 4°冰箱孵育過夜，PBS 緩沖液輕柔沖洗 3次，3min/次，除去 PBS 緩沖液后，滴加即用型二抗50μl，37℃恒溫箱孵育約 30 min。 PBS 沖洗 3 次，3min/次，DAB 染色液顯色后沖洗，蘇木素復(fù)染。 鹽酸分化，乙醇脫水 3 次，二甲苯透明 3 次，濕封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 結(jié)果判斷 LMP-1 染色定位于細胞質(zhì)；CD 10、CD5、CD21、CD30 染色定位于細胞膜；C-myc、Bcl-6、MUM-1 染色定位于細胞核；Livin 染色定位于細胞核、 細胞質(zhì)；BCL-2 染色定位于細胞質(zhì)、細胞膜。結(jié)果采用半定量法判定， 通過評估染色強度和計算腫瘤細胞陽性率來計分。 根據(jù)著色強度評分主要包括 4 類：0 分（無著色）；1 分（淡黃色）；2分（棕黃色）；3 分(棕褐色)。 腫瘤細胞陽性率計分：采用高倍視野計數(shù)每個組織芯上全部腫瘤細胞及其著色的陽性細胞， 然后計算出陽性腫瘤細胞占所有腫瘤細胞數(shù)的百分比， 根據(jù)細胞陽性率評分亦分 4 類：0 分為無腫瘤細胞著色；1 分為＜5%腫瘤細胞著色；2 分為 5%-50% 腫瘤細胞數(shù)陽性著色；3 分為＞50%腫瘤細胞數(shù)著色。綜合著色強度與腫瘤細胞陽性率的評分，兩者相加＜2 分為陰性，2-6 分為陽性。 由病理科 2 位高年資病理醫(yī)師鏡下觀察切片，判定染色結(jié)果，不能達成一致意見時，另外請病理主任醫(yī)師觀察切片， 一起商榷最終染色結(jié)果。

1.2.5 隨訪 所有納入研究的患者進行 9-83 個月隨訪 ，通過撥打患者家屬電話進行隨訪，內(nèi)容主要涉及患者生命體征，飲食、大小便，生活質(zhì)量、近期復(fù)查報告及用藥等情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 總生存(OS)期的計算從診斷確立到患者死亡或者隨訪終止。采用統(tǒng)計軟件（SPSS 17.0）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用卡方（χ2）檢驗及Fisher 確切概率法分析 Livin 蛋白表達與 DBLCL患者臨床病理特征及病理亞型的關(guān)系， 探究其表達與患者預(yù)后的關(guān)系。 單因素生存分析利用Kaplan-Meier 分析和 Log-rank 檢驗，以 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin 蛋白在彌漫大 B 細胞淋巴瘤的表達 利用免疫組織化學(xué)染色觀察Livin 蛋白在80 DLBCL腫瘤組織中的表達情況。實驗結(jié)果表明，Livin 蛋白染色主要定位于細胞質(zhì)、細胞核（圖 1）。Livin 在 80例DLBCL 組織標(biāo)本中， 其中50 例陽性表達 Livin蛋白，Livin 陽性表達率為62.5%。

2.2 Livin 蛋白的表達與DLBCL 患者臨床病理特征的關(guān)系 Livin 表達情況與DLBCL 患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系見表 1。 Livin 在臨床為I、II 分期的DLBCL 組織中高表達率為 54.72%， 臨床分期為III-IV 的DLBCL 組織中陽性表達率為 77.78%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。 Livin 在病理分型為GCB 型的DLBCL 組織中陽性表達率為 22.73%，在non-GCB 型的DLBCL 組織中陽性表達率為 77.59%,表達差異顯著（P＜0.05），與 DLBCL 患者性別、年齡、B 癥狀、IPI 評分、結(jié)外病灶無關(guān)（P＞0.05）。

2.3 Livin 蛋白的表達與DLBCL 患者生存期的關(guān)系 為了明確Livin 表達與患者預(yù)后的關(guān)系， 我們利用Kaplan-Meier 分析和Log-rank 檢驗探究其與患者生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，Livin 高表達患者中位生存期為 51 個月,不表達Livin 蛋白患者中位生存期長達 66 個月。 Livin 表達水平與 DLBCL 患者生存曲線的差異有關(guān)（P＜0.05，圖 2）。 Livin 在臨床為I、II 分期的DLBCL 組織中的表達與患者的生存期無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而在臨床分期為 IIIIV 的DLBCL 組織中的表達與患者的生存期有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖 3）。 高表達 Livin 可參與彌漫性大B 細胞性淋巴瘤的進展，提示預(yù)后不良。

3 討論

圖1 Livin 及其他蛋白在彌漫性大B 細胞淋巴瘤中的表達模式圖A 腫瘤細胞CD20 膜染色陽性EnVision 法高倍放大圖B 腫瘤細胞CD5 細胞膜染色陰性EnVision 法高倍放大圖C (非生發(fā)中心)腫瘤細胞 Livin 核、胞質(zhì)染色陽性EnVision 法高倍放大 圖D腫瘤細胞C-myc 染色陰性EnVision 法高倍放大圖 E 腫瘤細胞Bcl-2 細胞質(zhì)、細胞膜染色陰性EnVision 法高倍放大圖F 腫瘤細胞Bcl-6 核染色陽性EnVision 法高倍放大圖G （生發(fā)中心）腫瘤細胞Livin 核、胞質(zhì)染色陽性EnVision 法高倍放大圖H（Ⅰ/Ⅱ期）腫瘤細胞Livin 核、胞質(zhì)染色陽性EnVision 法高倍放大圖I（Ⅲ/Ⅳ期）腫瘤細胞Livin 核、胞質(zhì)染色陽性EnVision 法高倍放大圖J 淋巴結(jié)反應(yīng)性增生Livin 陰性EnVision 法高倍放大

Livin 又名黑色素瘤凋亡抑制蛋白(melanoma inhibitor of apoptosis protein， ML-IAP )或腎凋亡抑制蛋白 (kidney inhibitor of apaptosis protein, KIAP), 是人凋亡抑制蛋白 (human inhibitor of apoptosis proteins, IAPs) 家族的重要成員， 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8,9]。 目前研究表明,人類主要有8種 IAP:cIAP1、cIAP2、NAIP、XIAP、ILP -2、Bruce、Survivin 及 Livin[10]。 Livin 蛋白是 IAP 家族中新的一員, 是從人類基因組 cDNA 庫中由 IAP 同源序列克隆獲得, 可抑制半胱氨酸蛋白酶 (Caspase) 死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域活性[11]。Livin 定位于染色體20q13.3,具有兩種異構(gòu)體,分別為 Livin-α、Livin-β,其 cDNA長度分別為897、843bp,二者分布雖有一定差異,但總體上變化不大[11,12]。正常成人機體中Livin 只表達于胚胎及胎盤組織,未見于其他組織。 近年研究發(fā)現(xiàn),在中晚期結(jié)直腸癌[13,14]、乳腺癌[15]、肺腺癌[16]、髓母細胞瘤[17]等腫瘤瘤組織中，Livin 異常高表達，且其陽性表達者預(yù)后較差。 同時也提示Livin 可能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 本組研究結(jié)果表明,在DLBCL 中Livin 陽性率約為62.5%，且其陽性表達與臨床分期分期密切相關(guān), 進一步證實Livin 參與了 DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展過程。 GCB 型 DLBCL 患者Livin 陽性表達率顯著低于非GCB 型者,提示Livin可能與DLBCL 的起源有關(guān)。

表1 彌漫大B 細胞淋巴瘤中Livin 表達與臨床病理特征的關(guān)系

目前認(rèn)為,Livin 抑制細胞凋亡主要通過兩個途徑,即激活TAK1/JNK1 信號通路[18]、抑制Caspase途徑[19]。 細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)是由Caspase 家族引起的級聯(lián)反應(yīng)。 此外,有研究表明,利用反應(yīng)核苷酸技術(shù)(antisenseoligonucleotides, ASO),將硫代磷酸酯修飾的Livin 導(dǎo)入膀胱癌細胞中, 可以有效地靶向抑制Livin 的表達和削弱腫瘤細胞的增殖能力[20]。同時, 靶向抑制Livin 的表達可以增加腫瘤細胞對放療和化療藥物的敏感性[21],可作為設(shè)計和選擇分子靶向藥物的基礎(chǔ)。我們相信,通過對Livin 的深入研究, 特別是靶向抑制Livin 蛋白的表達, 有望為DLBCL 的診治提供一種理想的腫瘤治療方向。

圖2 Livin 的表達與DLBCL 患者預(yù)后

圖3 Livin 的表達與不同分期DLBCL 患者預(yù)后

綜上所述，Livin 在評估DLBCL 患者預(yù)后狀況中具有較高的判斷價值，Livin 的表達可能提示預(yù)后不良的趨勢。 是否可以通過檢測Livin 的表達情況，為DLBCL 患者尋找新治療方案提供理論依據(jù)仍需進一步研究。

利益沖突

本研究不存在利益沖突。

作者貢獻

易滬萍：免疫組織化學(xué)染色，論文撰寫；張福楊：收集標(biāo)本，參與實驗，數(shù)據(jù)整理；劉謙：切片制作、閱片；羅小江：研究設(shè)計、經(jīng)費支持。