Tet-on 調(diào)控BMP-2 基因表達(dá)的腺病毒載體構(gòu)建＊

溫家賓，肖裕華，陳鋼，李宇旭，龔飛鵬

（江西省人民醫(yī)院骨科，南昌 330006）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是一種高效的骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子，它能誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，BMP-2 是BMP 家族中第一個(gè)確定具有誘導(dǎo)成骨作用的因子。 BMP-2 不僅可以直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化， 也能夠增加成骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，因此BMP-2 成為骨質(zhì)疏松性骨折治療的重要靶點(diǎn)[1]。 由于蛋白類(lèi)藥物在體內(nèi)的半衰期短，藥物生物利用率低，作用于骨折部位的藥物濃度低。 因此， 尋求一種時(shí)效性的、 能在局部部位高表達(dá)BMP-2 的方法是治療骨折的關(guān)鍵[2]。 本研究擬通過(guò)構(gòu)建帶有四環(huán)素（tetracycline，Tet）正向調(diào)控系統(tǒng)Tet-on 的BMP-2 基因腺病毒載體，利用四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素與骨組織高親和性， 以及強(qiáng)力霉素在調(diào)控系統(tǒng)中起時(shí)間開(kāi)關(guān)作用的兩大優(yōu)勢(shì)， 為研究骨質(zhì)疏松性骨折的基因靶向性、時(shí)效性、可調(diào)控的精確治療提供一種全新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 含目的基因的pDC315-BMP-2 質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P生物有限公司提供，DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司， 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hycolon生物公司， 限制性?xún)?nèi)切酶Eco31I 購(gòu)自立陶宛MBI公司，dNTP 購(gòu)自美國(guó) Promega 公司，Marker 購(gòu)自北京天為時(shí)代生物公司，TaqDNA 聚合酶購(gòu)自立陶宛MBI 公司，DNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司，pAdenoX-Tet-On3GVector Adeno-X Rapid Titer Kit、StellarTM Competent Cells 購(gòu) 自 美國(guó) Clontech 公司，DNA Polymerase、DNA Extraction Kit、In-Fusion ?HD Cloning Kit、Plasmid Purification Kit 均購(gòu)自日本Takara 公司，購(gòu)自美國(guó)Clontech 公司，EndoFree Plasmid Maxi Kit 購(gòu)自德國(guó) Qiagen 公司。

1.2．方法

1.2.1 構(gòu)建腺病毒表達(dá)質(zhì)粒 以含有目的基因的pDC315-BMP-2 質(zhì)粒為模板，將約1200bp 片段目的基因克隆至pAdenoX-Tet-On 3G Vector 中，構(gòu)建Tet-on 腺病毒表達(dá)質(zhì)粒。具體操作如下：引物設(shè)計(jì)遵循 Adeno -XTMAdenoviral System 3 User Manual 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 使用 PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（Takara Code No. R050A），以 pDC315-BMP-2 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳后， 使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 （Takara Code No. 9762） 切膠回收目的約 1200bp 大小片段。 使用 In-Fusion? HD Cloning Kit ( Clontech Cat No. 639648 )， 將產(chǎn)物和 pAdenoX-Tet-On 3G Vector Set( Clontech Cat No. 631179 )連接。 使用EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen 貨號(hào) 12362)提取pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒。 使用Thermo Fisher Nanodrop2000 超微量可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

1.2.2 重組BMP-2 基因Tet-on 調(diào)控腺病毒 以含有目的基因的無(wú)內(nèi)毒素腺病毒表達(dá)質(zhì)粒為模板，制備單克隆重組腺病毒體。

1.2.2.1 Adeno-X 293 細(xì)胞培養(yǎng) Adeno-X 293 Cell Line( Cat No.632271），培養(yǎng)基為 DMEM（10%FBS），培養(yǎng)條件為 37℃、5% CO2，培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)基 DMEM（10%FBS）具體配方：90% 高糖DMEM 培養(yǎng)基, 4 mM 左旋谷酰胺, 3.7 g/L 碳酸氫鈉以及10%不含四環(huán)素的胎牛血清。

1.2.2.2 腺病毒體制備 (1)轉(zhuǎn)染前pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒溶液制備 在pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前，重組質(zhì)粒必須用Pac I酶進(jìn)行消化處理， 用以暴露病毒的末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs），ITRs 位于病毒基因組末端， 包含了病毒DNA 復(fù)制的起始部分，也是構(gòu)成復(fù)制復(fù)合體的重要組成部分，所以用PacI 消化暴露ITRs 制備出具有感染力的pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒溶液是轉(zhuǎn)染前的關(guān)鍵步驟。 (2) pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Adeno-X 293 細(xì)胞。 在轉(zhuǎn)染前 24h，將 Adeno-X 293 細(xì)胞以 1-2×106cells 的密度鋪于 60mm 培養(yǎng)皿。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，培養(yǎng)24h。觀察細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底約50%-70%，貼壁良好，用10μl 制備好的pAdenoBMP-2-Tet-On 表達(dá)質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)染每個(gè)培養(yǎng)皿。 轉(zhuǎn)染后每天顯微鏡下觀察細(xì)胞病理現(xiàn)象（cytopathic effect，CPE)，判斷病毒是否轉(zhuǎn)染成功。 轉(zhuǎn)染1 周后，完成腺病毒初次擴(kuò)增，PCR 鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2.3 含有目的基因的重組腺病毒擴(kuò)增、 純化及滴度檢測(cè) 在轉(zhuǎn)染前24h，將Adeno-X 293 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 T75 培養(yǎng)瓶中。 培養(yǎng)條件為 37℃、5% CO2，24h。 當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底達(dá)50%-70%時(shí)，將培養(yǎng)基移去， 重新每瓶中加入含有重組腺病毒的培養(yǎng)基5ml。 轉(zhuǎn)染條件為 37℃、5% CO2，90min。 移去培養(yǎng)基，重新加入10ml 新鮮培養(yǎng)基。 培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，3-4d。 觀察 CPE 現(xiàn)象，用 15ml 離心管收集細(xì)胞懸液。 用干冰將細(xì)胞液冰凍，然后在37℃水浴箱中解凍，反復(fù)3 次，分離病毒。 利用Adeno-X Rapid Titer Kit 檢測(cè)病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的提取 以含有 BMP-2 基因的pDC315-BMP-2 質(zhì)粒為模板，提取出約1200bp 片段基因（圖 1）。

圖1 對(duì)pDC315-BMP-2 質(zhì)粒酶切后成功獲得1233bpBMP-2 基因片段（產(chǎn)物1）

2.2 目的基因?qū)?pAdenoX-Tet-On 3G Vector將 BMP-2 基因片段導(dǎo)入 pAdenoX-Tet-On 3G Vector, 經(jīng)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后重新酶切產(chǎn)物， 所得質(zhì)粒（CTG083-2A-10） 測(cè)序結(jié)果與參考序列完全相同（圖2）， 表明目的基因成功和腺病毒Tet-on 載體連接。

圖2 Pac I 酶消化后得到特征DNA 條帶

2.3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，擴(kuò)增及滴度測(cè)定 重組腺病毒轉(zhuǎn)染Adeno-X 293 細(xì)胞后， 觀察到CPE 現(xiàn)象（圖 3），同時(shí)，培養(yǎng)7d 后細(xì)胞裂解產(chǎn)物 PCR 產(chǎn)物分析含有目的基因質(zhì)粒的特征條帶（圖4）。重組BMP-2 基因Tet-on 腺病毒擴(kuò)增純化后滴度測(cè)定結(jié)果：

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.02)，1000ul，6x109ifu/ml

圖3 病毒轉(zhuǎn)染7 天后，細(xì)胞出現(xiàn)CPE 現(xiàn)象，鏡下觀察細(xì)胞聚合，為腺病毒感染典型特征

圖4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，培養(yǎng)1 周取細(xì)胞裂解產(chǎn)物行3%瓊脂凝膠電泳，表明重組腺病毒所含目的基因成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.06)，1100ul，1x1010ifu/ml

3 討論

骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，它嚴(yán)重危害老年人健康。 由于老年人一般情況差，基礎(chǔ)疾病多，骨質(zhì)疏松程度重，骨折后往往愈合能力差，治療時(shí)間長(zhǎng)且伴隨風(fēng)險(xiǎn)及死亡率高，給患者、家庭和社會(huì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[3,4]。 因此，如何“又快又好”的治療老年人骨質(zhì)疏松性骨折無(wú)疑是一項(xiàng)十分具有挑戰(zhàn)性的課題。 研究發(fā)現(xiàn)，在老年骨質(zhì)疏松癥患者松質(zhì)骨中，BMP-2 基因表達(dá)水平較正常成年人顯著降低，證明BMP-2 與老年性骨質(zhì)疏松骨折的發(fā)病有著密切的聯(lián)系[5]，同時(shí)，BMP-2 基因的表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生后的愈合過(guò)程有著重要的的相關(guān)性，在骨折愈合的過(guò)程中，BMP-2 表達(dá)顯著升高[6]。

目前,基因治療骨質(zhì)疏松性骨折是一個(gè)新興的熱點(diǎn)，如構(gòu)建重組BMP-2 基因腺病毒或慢病毒載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及骨折部位局部注射，提高局部BMP-2 表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合，已經(jīng)表明可以成為骨質(zhì)疏松癥骨折基因治療重要方法[7,8]。但是，對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折而言，其骨折愈合過(guò)程中關(guān)鍵的血腫機(jī)化期和原始骨痂形成期持續(xù)約1-2 個(gè)月，其后主要通過(guò)功能鍛煉達(dá)到骨痂改造塑行的目的。 如果BMP-2 基因表達(dá)沒(méi)有在時(shí)間上受到調(diào)控， 則其在血腫機(jī)化演進(jìn)期和原始骨痂形成期可能表達(dá)不足，導(dǎo)致骨折延遲愈合，而骨痂改造塑行期若過(guò)度表達(dá),又可能導(dǎo)致骨折的畸形愈合。 同時(shí)，如果沒(méi)有在骨折部位上進(jìn)行靶向調(diào)控，BMP-2基因?qū)⒉粌H僅在骨組織中表達(dá)， 也可能會(huì)在骨外組織表達(dá)而造成異位骨化[9,10]，甚至導(dǎo)致腫瘤[11,12]發(fā)生。 所以，如何進(jìn)一步對(duì)BMP-2 進(jìn)行嚴(yán)密、特異、時(shí)效性地靶向調(diào)控， 成為了進(jìn)一步研究的重要方向[13,14]。

Tet-on 系統(tǒng)是目前應(yīng)用廣泛的四環(huán)素表達(dá)正向調(diào)控系統(tǒng)[15]，在沒(méi)有四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素（doxycycline，Dox）存在時(shí)，下游目的基因轉(zhuǎn)錄被抑制；加入強(qiáng)力霉素后，下游目的基因得到表達(dá)，可以利用強(qiáng)力霉素的開(kāi)關(guān)作用，起到時(shí)效性調(diào)控的作用。而且，人們發(fā)現(xiàn)作為T(mén)et-on 系統(tǒng)“鑰匙”的強(qiáng)力霉素具有明顯的“骨組織親合性”，可以和羥基磷灰石結(jié)合，組成強(qiáng)力霉素緩釋系統(tǒng)，形成強(qiáng)力霉素在骨組織的長(zhǎng)期緩慢釋放， 具有骨靶向性調(diào)控的作用[16]。 在 Zeng 等人的研究中，成功利用 Tet-on 系統(tǒng)調(diào)控?cái)y帶COLIA1 基因的腺病毒時(shí)效性、靶向性表達(dá)促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折大鼠愈合， 證明了Tet-on系統(tǒng)對(duì)于骨折愈合基因調(diào)控的兩大優(yōu)勢(shì)[17]。

基于以上治療方法及發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題， 本次研究成功構(gòu)建Tet-on 調(diào)控BMP-2 腺病毒載體，利用強(qiáng)力霉素與骨組織高親和性和強(qiáng)力霉素在基因調(diào)控系統(tǒng)中開(kāi)關(guān)作用的兩大優(yōu)勢(shì)， 為后期進(jìn)一步的體外及體內(nèi)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 該重組腺病毒載體的構(gòu)建成功，將可能使轉(zhuǎn)染后的BMP-2 基因不但能在骨組織中靶向表達(dá)， 而且能在血腫機(jī)化演進(jìn)期和原始骨痂形成期時(shí)多表達(dá)， 而骨痂改造塑行期少表達(dá)，達(dá)到時(shí)效性、靶向性基因治療改善骨質(zhì)疏松性骨折愈合作用機(jī)制的目的， 同時(shí)減少相應(yīng)的副反應(yīng)，為骨質(zhì)疏松性骨折的治療，提供了一個(gè)全新的思路。