急性髓系白血病中垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1 的表達(dá)及臨床意義＊

劉婷婷 ，劉海蕓 ，鄒燕 ，方全鋼 ，丁偉榮 ,2，柯波 ,2，朱青秀

（1.江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，南昌 330006；2.江西省血液腫瘤細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006；3.江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006）

急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）是一種根據(jù)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征具有多種亞型分類(lèi)的惡性血液腫瘤，此類(lèi)疾病遺傳背景復(fù)雜，具有高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為骨髓異常造血，并且傾向于老年患者（超過(guò)60%的患者年齡＞60 歲）[1]，因此在臨床診療中需要結(jié)合患者的遺傳學(xué)特點(diǎn)給予分層個(gè)體化治療。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年應(yīng)用PCR 技術(shù)從大鼠垂體腫瘤細(xì)胞中首次擴(kuò)增，并發(fā)現(xiàn)其在正常垂體細(xì)胞中表達(dá)為陰性[2]。 隨后研究發(fā)現(xiàn)PTTG1 為一種保全素抑制姐妹染色單體分離并在多種腫瘤細(xì)胞和惡性血液腫瘤中呈高豐度水平表達(dá)， 在正常組織細(xì)胞和血細(xì)胞中表達(dá)水平非常低， 因此可作為分子靶標(biāo)用于靶向治療[3,4]。PTTG1 作為一種致癌轉(zhuǎn)錄因子， 可參與多種生物學(xué)進(jìn)程，例如有絲分裂、DNA 損傷修復(fù)、基因調(diào)控、器官發(fā)育和代謝[5-9]。 盡管在實(shí)體腫瘤中PTTG1 基因的表達(dá)與臨床意義已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是在惡性血液腫瘤鮮有報(bào)道，PTTG1 在AML 中表達(dá)情況以及其與臨床的相關(guān)性， 國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)初治AML 和非惡性血液腫瘤對(duì)照組以及復(fù)發(fā)AML 組中PTTG1 基因的表達(dá)水平， 分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，以期為AML 的分層治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 骨髓標(biāo)本收集于2017 年9 月至2019 年12 月就診于江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科27例初次診斷為AML 患者，11 例AML 復(fù)發(fā)患者，中位年齡 56.5 歲,其中男 21 例，女 17 例；納入行骨髓穿刺檢查的非血液系統(tǒng)腫瘤疾病患者24 例 (對(duì)照組)，中位年齡 49.5 歲，男 13 例，女 11 例。 AML組與對(duì)照組患者年齡、 性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0.05) 。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 RNA 提取試劑盒（北京天根）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit （德國(guó) Qiagen 公司），Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根），PCR 八聯(lián)管、1.5ml 離心管和 PCR 管（無(wú)錫 NEST）,熒光定量PCR 儀（天隆TL988），低溫離心機(jī)（安徽中科）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA 提取 用 EDTA 抗凝管收集骨髓血2ml，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后加入紅細(xì)胞裂解液，離心后用PBS 清洗后加入1ml RNA 提取試劑，充分混勻后加入200μl 三氯甲烷, 混勻后4℃高速離心15 min； 小心吸取上清液500μl， 并加入等體積異丙醇，混勻后靜置10min；4℃高速離心15min，去上清液，并加入75%乙醇清洗；離心后去上清，待殘余乙醇揮發(fā)后加入 RNase-Free 水溶解RNA 沉淀，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)溶液中RNA 濃度和純度，OD260/OD280 比值處于1.6-2.1 之間的標(biāo)本進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.2 cDNA 合成 根據(jù)Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 取1μg RNA 溶液， 加入 5×gDNA buffer， 共 10μl 于普通 PCR 儀中 42℃反應(yīng)3min； 分別加入 FQ-RT primer、Fast-RT Buffer 和RT Enzyme Mix，共 20 μl 于普通 PCR 儀中 42℃反應(yīng) 20min，85℃反應(yīng) 3min。 反應(yīng)結(jié)束后加入 60 μl RNase-Free 水對(duì)cDNA 進(jìn)行稀釋。

1.3.3 熒光定量PCR 通過(guò)Primer 3 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，PTTG1 引物序列： 上游:5’-GTGGTTGCTAA GGATGGGCT-3’，下游:5’-TTGTTTGAGGGGTCCC TTGG-3’；β-catin 引物序列：上游：5’-GCACTCTT CCAGCCTTCCTT-3’，下游：5’-AGGTCTTTGCGGA TGTCCA-3’。 最后根據(jù) QuantiNova SYBR Green PCR Kit 說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)液，每管加入3 μl 稀釋的cDNA 溶液，按說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增程序并進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，得出擴(kuò)增曲線和溶解曲線。 采用 2-△△Ct計(jì)算 PTTG1 基因的相對(duì)定量表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTTG1 在AML 患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá) 熒光定量PCR 分析AML 組、正常對(duì)照組和復(fù)發(fā)組患者骨髓中PTTG1 基因的表達(dá)水平，AML 組中的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 復(fù)發(fā)組中 PTTG1 的表達(dá)水平低于 AML 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 PTTG1 基因在不同組別患者中表達(dá)水平

2.2 PTTG1 基因的表達(dá)與AML 患者臨床特征的關(guān)系 研究結(jié)果顯示，大于60 歲AML 患者中PTTG1的表達(dá)水平高于小于60 歲的AML 患者， 但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;不同性別之間 PTTG1 的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）；根據(jù)初治 AML 和復(fù)發(fā)AML 患者的FAB 診斷分型， 分析PTTG1 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示M2 型AML 中表達(dá)水平最高，M1 型中表達(dá)最低，但是兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。?中國(guó)診療指南 2017 年版》對(duì)AML 患者進(jìn)行危險(xiǎn)程度分層[10]，分析PTTG1 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，低危組中PTTG1 的表達(dá)水平最高，高危組中PTTG1 的表達(dá)水平最低，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 PTTG1 基因表達(dá)的臨床相關(guān)性

2.3 PTTG1 基因的表達(dá)與AML 患者外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓幼稚細(xì)胞比例的關(guān)系 通過(guò)分析AML患者外周血血常規(guī)以及骨髓涂片， 對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)，分析其與PTTG1 的表達(dá)水平的關(guān)系。研究 結(jié) 果 顯 示 ，WBC ≥50×109/L 的 AML 患 者 中PTTG1 的表達(dá)水平高于 WBC＜50×109/L 的 AML 患者，但是差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)血常規(guī)中血紅蛋白濃度判定患者的貧血程度， 分析發(fā)現(xiàn)重度貧血和中度貧血AML 患者中PTTG1 的表達(dá)水平明顯低于輕度貧血和正常AML 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;根據(jù)血小板計(jì)數(shù)分為不同組別， 其PTTG1 的表達(dá)水平無(wú)明顯差異 （P＞0.05）；根據(jù)骨髓涂片中幼稚細(xì)胞比例，分為0%-50%和50%-100%兩組， 結(jié)果顯示0%-50%組AML 患者中PTTG1 的表達(dá)水平高于50%-100%組， 但是差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 PTTG1 基因表達(dá)的外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)系

3 討論

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年從大鼠垂體腫瘤細(xì)胞中首次擴(kuò)增[2]。ChIP 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PTTG1 作為一種轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄活性， 其可以直接或者間接誘導(dǎo)與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)，PTTG1 與c-Myc 基因的啟動(dòng)子相結(jié)合并誘導(dǎo)表達(dá)[11]，除此之外，PTTG1 還通過(guò)誘導(dǎo) bFGF、VEGF 和MMP2 基因的表達(dá)從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。 PTTG1 除了通過(guò)與靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合參與細(xì)胞調(diào)節(jié)之外， 還可以與細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合參與細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，PTTG1 可以通過(guò)與p53、Sp1、USF1 和PBF 等蛋白相合作用來(lái)參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[15]。

有學(xué)者對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌的臨床研究表明，PTTG1 基因過(guò)表達(dá)組患者的中位生存期為1.8 年，而PTTG1 低表達(dá)組患者的中位生存期為9.0 年，結(jié)果提示PTTG1 的表達(dá)水平與疾病的預(yù)后相關(guān)并可以作為預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[16]。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)， 在胃癌組織和細(xì)胞株中PTTG1 的表達(dá)明顯較正常胃粘膜高， 通過(guò)對(duì)PTTG1 基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行多因素Cox 回歸分析顯示其表達(dá)水平可以作為胃癌的獨(dú)立的預(yù)后因素[17]。 在血液腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)在36-70%的多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者中PTTG1 基因過(guò)表達(dá)， 這部分患者中與增值相關(guān)基因也呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（CCNB1、CCNB2、CDK1、AURKA、BIRC5 和 DEPDC1） 并且與患者預(yù)后相關(guān)，敲除5TGM1 細(xì)胞中PTTG1 基因后明顯抑制細(xì)胞增殖， 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示明顯抑制MM 荷瘤的發(fā)展[18]。 然而，PTTG1 基因的表達(dá)調(diào)控在白血病的臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究中鮮有報(bào)答。 在對(duì)PTTG1 基因缺陷的小鼠的研究發(fā)現(xiàn)該小鼠具有血小板減少和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增生低下的現(xiàn)象[19]，還有研究發(fā)現(xiàn)佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)通過(guò)誘導(dǎo)PKC/ERK/KLF6 信號(hào)通路活化，KLF6 通過(guò)與PTTG1 基因啟動(dòng)子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄， 從而促進(jìn) HL60 細(xì)胞和 THP1 細(xì)胞分化[20]。

盡管多數(shù)研究證實(shí)PTTG1 基因在惡性腫瘤和血液腫瘤中呈高表達(dá)，但是PTTG1 基因在AML 中的表達(dá)及臨床相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。 白血病是一種源于分子遺傳學(xué)改變導(dǎo)致造血系統(tǒng)中原始造血細(xì)胞出現(xiàn)惡性增生伴隨分化阻滯的惡性疾病， 且具有高度的異質(zhì)性。 以上文獻(xiàn)報(bào)道提示，PTTG1 基因的異常表達(dá)可能影響血細(xì)胞的分化以及生物學(xué)功能。 本研究結(jié)果顯示初治AML 和復(fù)發(fā)AML 中PTTG1 基因的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組， 而且初治AML 和復(fù)發(fā)AML 中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 但是PTTG1 基因在AML 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及對(duì)疾病預(yù)后和危險(xiǎn)分層的作用尚未闡明。 本研究也通過(guò)分析PTTG1 基因在不同F(xiàn)AB 分型以及臨床危險(xiǎn)分層的AML 中的表達(dá)，結(jié)果顯示不同F(xiàn)AB 分型和危險(xiǎn)程度的AML 患者之間PTTG1 基因的表達(dá)并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 但是納入本研究的臨床病例較少，可能對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。 本研究還分析了不同血細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓幼稚細(xì)胞比例的患者之間的PTTG1 基因的表達(dá)差異， 結(jié)果顯示不同白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)以及幼稚細(xì)胞比例患者之間PTTG1 的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 重度貧血和中度貧血AML 患者中PTTG1 的表達(dá)水平明顯低于輕度貧血和無(wú)貧血的AML 患者。有文獻(xiàn)報(bào)道PTTG1 可參與白血病HL60 細(xì)胞和THP1 細(xì)胞分化[20],然而，是否通過(guò)參與紅細(xì)胞的成熟與分化調(diào)控影響AML患者的貧血狀況，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有待通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步的研究。 本課題組前期研究表明NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)AML 患者預(yù)后較差，是影響AML 患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一[21]。 本研究下一步將研究確定PTTG1 的表達(dá)與AML 預(yù)后的臨床相關(guān)性。

綜上所述，PTTG1 基因在AML 患者中表達(dá)水平高于非惡性血液腫瘤患者， 提示其可能參與AML 疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，PTTG1 基因的表達(dá)水平可能影響AML 患者的貧血狀況。