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    舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織ER、PR、PRLR表達及內(nèi)膜病理形態(tài)的影響

    2020-12-30 13:23:48項濤陳彪馬文擎翁艷潔
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年12期
    關(guān)鍵詞:舒爾催乳素孕激素

    項濤 陳彪 馬文擎 翁艷潔

    人工流產(chǎn)是暫無生育要求但意外懷孕女性的唯一補救措施,近年來,其發(fā)生率一直呈增加趨勢[1]。臨床上人工終止妊娠方法有手術(shù)流產(chǎn)和藥物流產(chǎn)兩種,其中,藥物流產(chǎn)較手術(shù)流產(chǎn)使用方便、痛苦小,被廣大婦女接受[2]。然而,盡管臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷進步,藥物流產(chǎn)的安全性與有效性也更有保障,但其弊端及不足仍存在。研究表明,藥物流產(chǎn)可能出現(xiàn)出血量大、出血時間長等副作用,進而可引發(fā)子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎等多種疾病,嚴(yán)重可導(dǎo)致不孕[3-4]。雌激素、孕激素、催乳素等是維持女性正常內(nèi)分泌的重要激素,分別通過與靶細胞上的雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、催乳素受體(prolactin receptor,PRLR)結(jié)合發(fā)揮作用,其分泌紊亂會引發(fā)子宮內(nèi)膜的一系列病理變化[5-7]。舒爾經(jīng)膠囊具有疏肝活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效,常用于痛經(jīng)、月經(jīng)量少、后錯屬氣滯血瘀證者,近年來發(fā)現(xiàn),其在流產(chǎn)術(shù)后子宮內(nèi)膜修復(fù)上具有一定療效[8]。本研究將通過研究舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織ER、PR、PRLR表達及內(nèi)膜病理形態(tài)的影響,以期為減少藥物流產(chǎn)副作用提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雌性SD大鼠50只,雄性大鼠25只,健康性成熟且未生育,體質(zhì)量(200±5)g,許可證號:SYXK(魯)2017-0030,購于山東新創(chuàng)生物科技有限公司。

    1.2 主要試劑與儀器

    舒爾經(jīng)膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20025985)購自海南博大制藥廠;宮血寧(國藥準(zhǔn)字Z20020087)購自云南白藥集團股份有限公司;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒(貨號:K1002S)購自美國Promega公司;ER、PR、PRLR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) mRNA引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;雌激素酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號:K3829-100)購自美國Biovision公司;孕激素ELISA試劑盒(貨號:CSB-E07282r)購自美國Cusabio公司;催乳素ELISA試劑盒、ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(貨號:ab100736、ab3575、ab63605、ab214303、ab181602)購自abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國santa公司;光學(xué)顯微鏡(型號:SZ51/SZ61)購自日本Olympus/奧林巴斯;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號:ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

    1.3 藥物流產(chǎn)大鼠模型制備、分組與給藥

    將大鼠于下午5:00按雌雄2∶1合籠交配,次日上午8:00行雌鼠陰道涂片檢查,以檢出精子的當(dāng)天為妊娠第1天。未檢出精子的雌鼠于下午5:00繼續(xù)合籠交配,連續(xù)3天,共獲得妊娠大鼠40只。

    將40只妊娠大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組和舒爾經(jīng)膠囊高劑量組,每組8只。模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組和舒爾經(jīng)膠囊高劑量組妊娠大鼠于妊娠第7天上午8:00給予米非司酮16.6 mg/kg灌胃1次,于下午18:00給予米索前列醇100 μg/kg灌胃1次,制作大鼠藥物流產(chǎn)模型。

    造模成功后次日,空白對照組、模型組給予生理鹽水,陽性對照組給予宮血寧10 mg/kg,舒爾經(jīng)膠囊低、高劑量組分別給予舒爾經(jīng)膠囊190 mg/kg、330 mg/kg,每天給藥1次,給藥體積均為1.0 mL/100 g體重,連續(xù)7天。

    1.4 標(biāo)本采集

    各組大鼠給藥結(jié)束后24小時內(nèi),給予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,將大鼠處死,分離大鼠子宮。

    1.5 蘇木素-伊紅(hematoxylin-Eosin,HE)染色觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化

    子宮組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化。子宮所有形態(tài)改變根據(jù)以下評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分:①0分:胚囊完整,絨毛與蛻膜殘留多;②1分:胚囊排出,無絨毛殘留,較多蛻膜組織殘留;③2分:胚囊排出,無絨毛殘留,少量蛻膜組織殘留或子宮內(nèi)膜修復(fù)不好;④3分:胚囊排出,無絨毛殘留,無蛻膜組織殘留,子宮內(nèi)膜未較好修復(fù);⑤4分:胚囊排出,無絨毛殘留,無蛻膜組織殘留,子宮內(nèi)膜較好修復(fù)。

    1.6 ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平

    將腹主動脈血4℃ 3000 r/min,離心10分鐘,取上層血清。ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平,試驗方法均按照試劑盒說明書進行,酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值,計算血清雌激素、孕激素、催乳素水平。

    1.7 qRT-PCR法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平

    使用TRIzol試劑提取各組子宮組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用qRT-PCR法檢測ER、PR、PRLR mRNA表達水平,內(nèi)參基因為GAPDH。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10分鐘;95℃變性10秒,55℃退火35秒,72℃延伸1分鐘,循環(huán)40次;72℃延伸10分鐘。ER上游引物:5′-CCACCAACCAGTGCACCATT-3′,下游引物:5′-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTTC-3′;PR上游引物:5′-TCGTACAAGCATGTCAGTGGACAC-3′,下游引物:5′-CATGGTAAGGCACAGCGAGTACAA-3′;PRLR上游引物:5′-CCAGATGGAAGTGTACTGCTTGGTA-3′,下游引物:5′-GGTGGAATCCTGGGACAGATC-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-CCACTTGAAGGGTGGAGC-3′,下游引物:5′-TGAAGTCGCAGGAGACAA-3′。Ct值為擴增產(chǎn)物的熒光信號達到臨界閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù),相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

    1.8 蛋白印跡(western blot,WB)法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平

    使用蛋白提取試劑盒提取各組子宮組織中總蛋白,使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1小時,分別加入ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(1∶500),4℃孵育過夜,TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000),室溫孵育1小時,免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮內(nèi)膜病理形態(tài)的影響

    空白對照組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整,上皮細胞排列緊密,血管和腺體清晰可見。模型組子宮內(nèi)膜嚴(yán)重受損,腺體和血管稀少,子宮內(nèi)膜變薄明顯。與模型組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組子宮內(nèi)膜的厚度及子宮內(nèi)膜腺體、血管數(shù)量明顯增加,大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05);與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組,大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05);陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

    注: A:空白對照組;B:模型組;C:陽性對照組;D:舒爾經(jīng)膠囊低劑量組;E:舒爾經(jīng)膠囊高劑量組。

    表1 各組大鼠子宮組織病理學(xué)評分比較

    2.2 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平的影響

    與空白對照組相比,模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平均顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05);與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05);陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    2.3 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平的影響

    與空白對照組相比,模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    2.4 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平的影響

    與空白對照組相比,模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

    表2 各組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平比較

    表3 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平比較

    表4 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平比較

    圖2 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達情況

    3 討論

    數(shù)據(jù)顯示,中國每年人工流產(chǎn)約有1300萬人次,藥物流產(chǎn)約有1000萬人次,位居世界第一,盡管各種避孕方法正在不斷推廣,但人工流產(chǎn)的發(fā)生率仍在不斷增加[9]。手術(shù)流產(chǎn)為機械性操作,對機體損傷大,易導(dǎo)致盆腔炎、月經(jīng)紊亂等并發(fā)癥,恢復(fù)時間長,大多數(shù)女性難以完全接受,而藥物流產(chǎn)通常具有安全、有效、簡便等特點,更易被人接受[10]。然而,藥物流產(chǎn)后流產(chǎn)不全、絨毛蛻膜殘留、子宮收縮乏力及繼發(fā)宮內(nèi)感染會導(dǎo)致月經(jīng)紊亂、貧血、異常子宮出血、盆腔炎、不孕等危害,是藥物流產(chǎn)亟需進一步解決的問題[11]。

    舒爾經(jīng)膠囊成分為當(dāng)歸、牡丹皮、赤芍、柴胡、桃仁、陳皮、香附、牛膝、益母草、延胡索、白芍,主要用來治療痛經(jīng)及月經(jīng)量少等癥狀[12]。近年來發(fā)現(xiàn),舒爾經(jīng)膠囊在治療人工流產(chǎn)并發(fā)癥上具有較好的療效。杜就舊等[13]研究表明,舒爾經(jīng)顆粒聯(lián)合戊酸雌二醇預(yù)防人工流產(chǎn)術(shù)后宮腔粘連的療效優(yōu)于單用戊酸雌二醇。孫川等[8]研究表明,人流術(shù)后采用舒爾經(jīng)顆粒聯(lián)合補佳樂進行治療,可以縮短流產(chǎn)后出血時間及轉(zhuǎn)經(jīng)時間,改善臨床癥狀及體內(nèi)性激素水平,增加子宮內(nèi)膜厚度。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高,子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜腺體、血管數(shù)量顯著增加,其中膠囊高劑量組大鼠相應(yīng)指標(biāo)與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明舒爾經(jīng)膠囊可促進胚囊排出,減少絨毛、蛻膜殘留,增加子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜腺體,促進血管生成,使子宮內(nèi)膜得到較好地修復(fù),效果與傳統(tǒng)藥物宮血寧相差不大。

    雌激素、孕激素、催乳素是維持女性正常內(nèi)分泌、反映婦科內(nèi)分泌功能的重要激素,在妊娠過程中,正常的雌激素、孕激素、催乳素等激素水平與子宮內(nèi)膜中激素受體結(jié)合,在子宮內(nèi)膜變化中起重要作用[14-16]。Chlebowski等[17]研究表明,孕激素可減輕子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險,在絕經(jīng)后婦女中,孕激素聯(lián)合雌激素連續(xù)使用可降低子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。Mei等[18]研究表明,雌激素可以通過CXCL12/CXCR4生物軸上調(diào)介導(dǎo)的自噬抑制促進人分泌期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的存活。宋秀云等[19]研究表明,對于臨床上選擇藥物流產(chǎn)的患者,為了減輕流產(chǎn)后陰道出血量,可在治療中加用雌激素、孕激素,不僅能提高止血效果,還可減少并發(fā)癥。李福明等[20]研究表明,扶正消癌方聯(lián)合他莫昔芬調(diào)節(jié)血清催乳素、孕酮、雌二醇等性激素水平,可緩解他莫昔芬所致子宮內(nèi)膜增厚。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應(yīng)受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低,提示大鼠藥物流產(chǎn)后子宮內(nèi)膜嚴(yán)重受損,體內(nèi)性激素及相應(yīng)受體表達均受到影響。進一步研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應(yīng)受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著升高,提示舒爾經(jīng)膠囊可提高藥物流產(chǎn)大鼠血清中性激素及子宮內(nèi)膜中相應(yīng)受體水平,進而使嚴(yán)重受損的子宮內(nèi)膜得到修復(fù)。

    綜上所述,舒爾經(jīng)膠囊可以提高藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR表達水平,促進子宮內(nèi)膜修復(fù),改善子宮內(nèi)膜形態(tài),值得進一步進行臨床研究。

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