PD-1/PD-L1信號通路在慢性乙型肝炎患者免疫調(diào)節(jié)中作用的研究進展

劉嬌，戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，趙川

1遂寧市中心醫(yī)院，四川遂寧629000；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

乙型肝炎病毒(HBV)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的病原體。據(jù)報道，全球每年約有65萬人死于HBV相關(guān)性肝衰竭、肝硬化及肝癌[1]。乙型肝炎發(fā)病機制十分復(fù)雜且尚未形成共識。HBV感染后的病程及轉(zhuǎn)歸與病毒、宿主間的免疫應(yīng)答關(guān)系密切，特別是T淋巴細胞介導(dǎo)下的細胞免疫。T淋巴細胞數(shù)量減少及功能衰竭是導(dǎo)致病毒不能被有效清除而誘發(fā)HBV感染后慢性化的主要原因之一。程序性死亡分子1(PD-1)及其配體(PD-L)是新發(fā)現(xiàn)的B7/CD28家族成員之一，是具有負性協(xié)同共刺激信號的調(diào)節(jié)分子。PD-1在慢性感染性及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要的調(diào)控作用。這些疾病發(fā)生的病原體或誘導(dǎo)疾病發(fā)生的影響分子與PD-L結(jié)合形成信號通路后，誘導(dǎo)其向T淋巴細胞傳遞負性刺激信號，導(dǎo)致T淋巴細胞數(shù)量減少，生物學(xué)功能衰減，T淋巴細胞介導(dǎo)下的免疫應(yīng)答減弱。本文就PD-1/PD-L1信號通路對慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫調(diào)節(jié)的影響作一綜述。

1 PD-1/PD-L1信號通路概述

1.1 PD-1、PD-L1的結(jié)構(gòu)及表達 CD279是Ishida等[2]于1992年從凋亡的T淋巴細胞膜上分離出的單體型Ⅰ型跨膜糖蛋白，稱為PD-1。PD-1由288個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為55 kD。PD-1由胞外的N端域、跨(穿)膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分組成，與CD28、CTLA-4分別有28%、23%的氨基酸同源性[3]。其胞外區(qū)由含有4個N端連接的糖基化位點構(gòu)成的IgV樣結(jié)構(gòu)域，PD-1/PD-L1信號通路主要通過4個N端連接的糖基化位點發(fā)生去磷酸化；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的N端酪氨酸殘基通過免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)來發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)PD-1、PD-L1結(jié)合時，ITSM可募集磷酸酶(SHP-1、SHP-2)誘導(dǎo)B淋巴細胞受體或T細胞受體傳遞的效應(yīng)信號發(fā)生去磷酸化，從而發(fā)揮負性調(diào)節(jié)抗原信號的作用[4]。PD-1廣泛表達于CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)及單核細胞等膜表面，而靜息狀態(tài)下的T淋巴細胞表面不表達PD-1[5，6]。

PD-1有PD-L1、PD-L2兩個配體。PD-L1與PD-L2有70%的氨基酸同源性，其中有40%氨基酸為一致性。PD-L1由290個氨基酸組成，胞外區(qū)由IgV和IgC樣兩個結(jié)構(gòu)域。PD-1與PD-L1間的融合主要發(fā)生在IgV樣結(jié)構(gòu)域。PD-L1分布較PD-1更為廣泛，其除在PD-1表達的細胞表面外還可在正常器官如胎盤、心臟、肝、肺等多種組織細胞表面被誘導(dǎo)表達[7]。PD-L2的表達則較PD-1、PD-L1局限，主要在T淋巴細胞、樹突狀細胞、血管內(nèi)皮細胞、星狀細胞以及肝竇內(nèi)皮細胞等細胞膜表面表達[8]。

1.2 PD-1/PD-L1信號通路的生物學(xué)功能 PD-L1對外周組織有保護作用，保護外周組織不因自身免疫紊亂而受到攻擊。實質(zhì)細胞通過PD-1/PD-L1信號通路維持機體的免疫耐受狀態(tài)；PD-1/PD-L1信號通路被阻斷或破壞時，可誘發(fā)或加重慢性感染，促進自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展及腫瘤的發(fā)生[9]。實驗研究結(jié)果顯示，PD-1/PD-L1信號通路具有傳遞負性調(diào)節(jié)信號的功能，可抑制T淋巴細胞活化、增殖及分化，減少γ-干擾素因子(IFN-γ)、白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素2(IL-2)等細胞因子分泌，導(dǎo)致T淋巴細胞生物學(xué)功能減弱，減低機體對病毒的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致病毒持續(xù)復(fù)制，疾病慢性化。Barber等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在淋巴脈絡(luò)叢腦膜病毒感染的小鼠體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表面PD-1表達上調(diào)，外周血T淋巴細胞表面水平及其分泌的細胞因子水平降低。研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒、人類免疫獲得性病毒及人類T淋巴細胞病毒等感染中，PD-1在特異性CD8+T和CD4+T細胞膜上表達水平與病毒載量呈正相關(guān)[10]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，在阻斷PD-1/PD-L1信號通路后，PD-1、PD-L1表達下降，T淋巴細胞載量及功能、細胞因子分泌功能有所恢復(fù)，活躍的病毒復(fù)制狀態(tài)得到控制[11]。這表明阻斷PD-1/PD-L1信號通路可作為治療慢性病毒感染的新方向。

2 PD-1/PD-L1信號通路對CHB患者免疫的調(diào)節(jié)作用

2.1 PD-1/PD-L1信號通路與CHB的關(guān)系 乙型肝炎的發(fā)病機制十分復(fù)雜，大部分學(xué)者認(rèn)為宿主免疫功能失衡是其病理性損傷及感染慢性化的主要原因之一；同時指出CHB是免疫介導(dǎo)的疾病，其發(fā)生發(fā)展與機體免疫活化、肝細胞損傷有關(guān)，最終疾病的控制需依賴于機體的免疫狀態(tài)。因此免疫調(diào)節(jié)是CHB治療的一個非常重要的環(huán)節(jié)。T淋巴細胞作為細胞免疫的主要效應(yīng)細胞，其數(shù)量、功能、亞群比例及細胞因子分泌等與HBV持續(xù)感染或感染后的慢性化密切相關(guān)。T淋巴細胞在雙信號的誘導(dǎo)下激活，一是T細胞受體專性識別抗原呈遞細胞表面的肽復(fù)合物信號刺激；二是T細胞表面的膜蛋白分子及其配體介導(dǎo)的共刺激信號作用。其中CD28/B7、ICOS/B7-H2等正性共刺激分子途徑傳遞活化信號，刺激T細胞增殖和分化；而PD-1/PD-L1作為負性共刺激信號途徑傳遞抑制信號，導(dǎo)致T淋巴細胞凋亡，功能減弱，CHB患者形成免疫耐受狀態(tài)。PD-1、PD-L1作為負性共刺激分子傳遞活化信號在CHB免疫調(diào)節(jié)、疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。Liu等[12]阻斷HBV感染土撥鼠PD-1/PD-L1信號通路，小鼠外周血特異性T淋巴細胞功能得以恢復(fù)，并認(rèn)為PD-1/PD-L1信號通路在HBV感染中具有負性調(diào)控作用。孫立華等[13]研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血CTL表面PD-1、PD-L1的表達高于健康體檢組，且PD-1、PD-L1表達水平與HBV-DNA載量呈正相關(guān)系。Liang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CHB免疫清除階段PD-1表達水平高于免疫耐受階段、靜止期病毒攜帶階段?？梢?，PD-1、PD-L1表達在一定程度上反映了CHB患者的免疫功能及病情嚴(yán)重程度。

CD4+T細胞為T淋巴細胞中的一種輔助性T淋巴細胞，主要通過分泌IFN-γ、IL-17、IL-10及IL-2等細胞因子來誘導(dǎo)和促進B細胞、CTL及其他免疫細胞的活化、增殖與分化，從而介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答。CD8+T細胞具有殺傷效應(yīng)細胞和調(diào)節(jié)細胞免疫的作用，是清除病毒的關(guān)鍵細胞亞群，若應(yīng)答失敗會導(dǎo)致病毒處于高水平狀態(tài)且不能被清除。在CHB患者中，CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達增加，PD-1/PD-L1信號通路傳遞負性信號因子，導(dǎo)致CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量減少，功能減退，導(dǎo)致具有抗病毒作用的腫瘤壞死因子α、IFN-γ等細胞因子水平降低。Peng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，活動期CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達明顯高于急性乙型肝炎恢復(fù)期患者。Fan等[16]研究也表明，CHB患者CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達較急性乙型肝炎恢復(fù)期患者高，CHB患者外周血CD8+T淋巴細胞功能和數(shù)量衰減更為明顯。車財妍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血CD4+T和CD8+T淋巴細胞PD-1的熒光強度明顯高于HBV攜帶者。肝組織內(nèi)CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達高于外周血[18]。在HBV感染初期，CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達明顯上調(diào)，但隨著患者病情狀況的改善和病毒清除，PD-1表達下調(diào)，CD8+T淋巴細胞的生物功能和增殖能力復(fù)常[15]。PD-1高表達可抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的增殖與分化，這可能因為機體為控制過強免疫應(yīng)答而發(fā)生的自我調(diào)控，防止T淋巴細胞的過度免疫攻擊，避免肝組織損傷，但也成為HBV慢性感染的原因之一。

HBV-DNA是反映病毒復(fù)制水平最直接的指標(biāo)之一。HBV-DNA高載量可誘導(dǎo)PD-1、PD-L1高表達，但同時隨著病毒載量的降低與清除，PD-1、PD-L1的表達也隨之下降。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者高病毒載量組(HBV-DNA>105)外周血T淋巴細胞膜上PD-1表達較低病毒載量組(HBV-DNA<105)增加。葉翩等[20]研究結(jié)果顯示，CHB患者CD8+T淋巴細胞表面的PD-1、PD-L1表達高于健康者，并發(fā)現(xiàn)CHB患者CD8+T淋巴細胞表面的PD-1/PD-L1表達與HBV-DNA載量呈正相關(guān)。但也有部分學(xué)者認(rèn)為，CHB患者外周血PD-1/PD-L1表達水平與HBV DNA載量無相關(guān)性，且認(rèn)為外周血T/B淋巴細胞表面PD-1/PD-L1水平與健康體檢組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，同時有學(xué)者臨床研究認(rèn)為，CHB患者HBV-DNA陽性組的外周血CD4+T/CD8+T淋巴細胞表面的PD-1/PD-L1表達水平較陰性組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[21]。HBV-DNA載量與PD-1/PD-L1兩者之間相互關(guān)系尚未形成共識，有待更進一步地進行大數(shù)據(jù)、多中心研究來明確。

2.2 PD-1/PD-L1信號通路在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換中的作用 HBeAg是一種可溶性多肽蛋白，多見于血清中HBsAg陽性患者。HBeAg陽性表示患者處于高感染低應(yīng)答期，HBeAg陰性而抗HBe陽性稱為e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換，表明CHB患者機體由免疫耐受轉(zhuǎn)為免疫激活狀態(tài)，此時常處于病變活動的激化狀態(tài)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，每年發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的CHB患者約占10%。血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，多數(shù)患者體內(nèi)病毒復(fù)制處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，傳染性也相對降低。研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg可促進PD-1/PD-L1高表達，HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換與CHB患者外周血清中HBV-DNA病毒載量及T淋巴細胞表面PD-1表達密切相關(guān)[22]。Tang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性患者CD8+T細胞膜上PD-1表達高于HBeAg陰性患者。柳紅梅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性組外周血CD4+T淋巴細胞表面的PD-1表達上調(diào)，并與HBeAg水平呈正相關(guān)。PD-1/PD-L1信號通路可能參與并誘導(dǎo)了HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，這也可能是機體發(fā)生免疫耐受的機制之一。

2.3 PD-1/PD-L1與肝組織炎癥程度的相關(guān)性 ALT/AST在肝組織發(fā)生炎癥時釋放入血，是目前反映肝細胞損傷的最常用指標(biāo)。在HBV持續(xù)性感染時，會導(dǎo)致肝細胞損傷，肝細胞胞漿及線粒體內(nèi)的多種轉(zhuǎn)氨酶釋放入血所致。已有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1表達水平與肝組織炎癥損傷程度密切相關(guān)，隨CHB患者的炎癥程度加重其外周血的PD-1/PD-L1表達水平顯著升高。韋麟等[25]研究發(fā)現(xiàn)PD-1表達水平與肝組織炎癥活動度呈正相關(guān)，在肝組織未出現(xiàn)明顯炎癥時(G0期)，肝組織內(nèi)PD-1低水平表達。在肝組織炎癥活動度在G1-4期時，PD-1在肝組織內(nèi)的表達水平高表達，隨肝組織炎癥程度加重，PD-1表達水平顯著升高，G4期的PD-1表達水平較G0～1期顯著升高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Germanidis等[26]研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1及CD8+T水平與肝組織炎癥程度呈正相關(guān)。Feng等[27]研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1水平與ALT/AST呈正相關(guān)系，表PD-1/PD-L1信號通路通過干擾調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能，加速了HBV感染患者病情進展。Xu等[28]通過檢測CHB患者外周血PD-1表達水平與患者ALT、AST水平及病毒載量呈正相關(guān)，表明PD-1可作為一個潛在反映肝組織損傷和病毒復(fù)制水平的指標(biāo)之一。但也有部分學(xué)者認(rèn)為PD-1與ALT/AST及TBIL等反映肝組織炎癥活動指標(biāo)無明顯相關(guān)性，僅與T淋巴細胞數(shù)量、HBV-DNA載量及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換相關(guān)[23]。

2.4 PD-1/PD-L1信號通路在CHB抗病毒治療中的作用

2.4.1 干擾素 干擾素及核苷(酸)類似物(NAs)是目前抗HBV治療的主要藥物。干擾素主要通過介導(dǎo)機體免疫狀態(tài)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細胞因子及抗病毒蛋白，在多個環(huán)節(jié)上抑制病毒復(fù)制，從而增強機體清除病毒能力。核苷(酸)類似物主要作用于HBV聚合酶，取代病毒復(fù)制過程中延長聚合酶鏈所需結(jié)構(gòu)相似的核苷物，從而抑制病毒復(fù)制?？共《局委熆蓽p少CHB患者外周血細胞表面及肝組織中PD-1的表達，抑制病毒特異性T淋巴細胞的負向調(diào)控作用，恢復(fù)T淋巴細胞清除病毒功能和增殖活性，減輕肝組織炎癥，延緩病情進展。

研究發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇α-干擾素抗病毒治療過程中，隨著HBV-DNA載量的下降，CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達下調(diào)，CD8+T淋巴細胞功能也隨之恢復(fù)，從而加快HBV清除[29]。梁雪松等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在聚乙二醇α-干擾素抗HBV治療12周時，HBV-DNA載量降低，PD-1陽性的CD8+T細胞比例較基線降低；當(dāng)治療到12～24周時PD-1陽性CD8+T細胞比例降低，但下降速度減緩，相應(yīng)病毒載量下降幅度也隨之減弱。提示干擾素可下調(diào)CD4+T淋巴細胞的免疫活性，增強CD8+T細胞抗病毒功能，減輕免疫損傷。程健等[31]發(fā)現(xiàn)，在抗病毒治療早期，CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的PD-1表達逐漸降低，同時段患者血清中HBV-DNA載量和肝功能損傷指標(biāo)水平也隨之降低，認(rèn)為抗病毒治療初期CHB患者外周血T淋巴細胞上PD-1表達變化可作為抗病毒治療效果和疾病預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)之一?？傊?，干擾素治療可明確調(diào)控CHB患者PD-1、PD-L1表達，促進HBV清除和肝組織炎癥恢復(fù)。

2.4.2 NAs NAs能夠快速抑制HBV復(fù)制，降低促炎性細胞因子水平，促進肝組織炎癥復(fù)常。NAs抗病毒治療過程中，不僅患者體內(nèi)病毒載量下降，其外周血PD-1、PD-1表達及肝損傷指標(biāo)(ALT、AST)水平也下降。恩替卡韋(ETV)是目前廣泛應(yīng)用于臨床抗HBV DNA治療的主要核苷酸類藥物之一，其能有效抑制對拉米夫定耐藥及野生型HBV，具有安全、高效、低耐藥性的特點。張玉喜等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在ETV抗病毒治療24周，CHB患者外周血單核細胞表面PD-1，PD-L1表達降低，病毒載量顯著減少，肝組織炎癥復(fù)常。同時有研究發(fā)現(xiàn)，NAs治療24周，CHB患者HBV-DMA載量和肝功能較治療前明顯好轉(zhuǎn)，外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1、PD-L1表達較治療前下調(diào)[33]。有研究通過對35例血清HBeAg陽性的CHB患者抗病毒治療1年觀察發(fā)現(xiàn)，期外周血HBV-DNA、ALT及CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1表達較治療前降低。HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組PD-1表達、病毒載量及ALT水平較未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組下降更顯著[34]?？梢姡琋As抗病毒治療可下調(diào)T細胞表面PD-1、PD-L1表達，促進T淋巴細胞生物學(xué)功能恢復(fù)，抑制病毒復(fù)制，改善病情。阻斷PD-1/PD-L1負性協(xié)同信號通路對改善患者免疫功能有一定改善作用。

PD-1/PD-L1信號通路在HBV感染引起的免疫損傷反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。該信號通路通過上調(diào)T淋巴細胞水平調(diào)節(jié)機體免疫功能，誘導(dǎo)機體免疫耐受，導(dǎo)致病毒感染持續(xù)和疾病慢性化。但隨著PD-1、PD-L1表達升高也可阻斷機體過度的免疫損傷，避免誘發(fā)肝衰竭。阻斷PD-1/PD-L1信號通路可使T淋巴細胞數(shù)量和功能復(fù)常，增強其抗病毒能力，其可能也將成為治療CHB的一個新免疫靶點。PD-1通路抑制劑已在臨床應(yīng)用于腫瘤及自身免疫性疾病的治療，但尚未用于CHB患者的治療。在CHB的不同免疫階段PD-1、PD-L1表達存在差異，因此阻斷PD-1/PD-L1信號通路的時機尤其重要。這有待進一步研究。