循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)在胃癌中的應(yīng)用進(jìn)展

席小霞，石定

河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州450000

胃癌是發(fā)病率和病死率極高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居惡性腫瘤第3位[1]。胃癌早期缺乏顯著的臨床特征，大多數(shù)患者確診時(shí)已失去最佳治療時(shí)機(jī)，從而大大降低了5年生存率及生活質(zhì)量。因此，胃癌的早期診療尤為重要，但臨床腫瘤標(biāo)記物診斷早期胃癌的靈敏度與特異度不高。液體活檢是一種利用腫瘤患者體液中的循環(huán)生物標(biāo)志物來提供腫瘤遺傳信息的體外診斷技術(shù)，主要用于檢測(cè)和分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，作為腫瘤患者基因組和蛋白質(zhì)組信息的來源。ctDNA檢測(cè)即是液體活檢的一種。循環(huán)腫瘤DNA不僅可作為診斷胃癌的生物標(biāo)志物之一，還可用于胃癌基因突變、擴(kuò)增、甲基化檢測(cè)以及早期診斷、預(yù)后等監(jiān)測(cè)。本文就ctDNA在胃癌中基因檢測(cè)和臨床應(yīng)用作一綜述。

1 ctDNA的生物學(xué)特性

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是由正常細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞等凋亡、壞死后釋放到血液中的游離DNA，通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核小體游離于循環(huán)中，來源于腫瘤的這部分cfDNA，稱為ctDNA。1948年，Mande等[2]首次在人體血液中檢測(cè)到cfDNA。然而，對(duì)cfDNA的了解僅限于它與自身免疫性疾病及慢性炎癥的關(guān)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、胰腺炎、炎癥性腸病和肝炎。1977年，Leon等[3]發(fā)現(xiàn)，癌癥患者循環(huán)血漿DNA水平增加。ctDNA是一種以單鏈或雙鏈DNA的形式存在于動(dòng)物和人類的血液(血漿或血清)、滑膜液或其他體液中的一種游離DNA，其長(zhǎng)度小于180 bp，濃度為3.6～5.0 ng/mL[4]。ctDNA產(chǎn)生的機(jī)制目前尚未完全清楚，其在腫瘤患者血液中的增加可能是多種方式共同作用的結(jié)果[4,5]。

2 胃癌患者ctDNA檢測(cè)

ctDNA檢測(cè)分為定性和定量檢測(cè)。研究表明，ctDNA與腫瘤內(nèi)部的DNA具有相同的遺傳信息改變?nèi)缁蛲蛔?、腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子的高甲基化、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性和雜合度的損失[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA水平與腫瘤大小、TNM分期密切相關(guān)，而與患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)[7]。用qPCR檢測(cè)術(shù)前53例胃癌患者和21例健康對(duì)照者的ctDNA水平，結(jié)果顯示胃癌患者的ctDNA水平高于健康對(duì)照組，胃良性腫瘤患者的ctDNA水平與健康患者的ctDNA水平無明顯差異[8～10]。

2.1 DNA突變檢測(cè) Hamakawa等[10]對(duì)含有TP53突變的胃癌患者血漿ctDNA進(jìn)行大規(guī)模平行深度靶向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10例TP53突變患者中有3例術(shù)前ctDNA中可檢測(cè)出TP53突變。Fang等[11]分析了277例原發(fā)性胃癌患者血漿ctDNA中8種基因(ARID1A、TP53、PIK3CA、PTEN、AKT3、BRAF、AKT2、AKT1)的突變譜，發(fā)現(xiàn)ctDNA中TP53、ARID1A、PI3KCA是胃癌患者最常見的突變基因，且ctDNA高水平的患者比ctDNA低水平的患者更易出現(xiàn)血管侵犯，且患者5年生存率低。

2.2 DNA甲基化檢測(cè) 研究指出，胃癌患者ctDNA中基因甲基化異常預(yù)后較差[12]。Pimson等[13]研究發(fā)現(xiàn)，101例晚期胃癌患者中85%～95%患者血漿ctDNA中存在PCDH10和RASSF1A甲基化。Balgkouranidou等[14]對(duì)73例Ⅰ～Ⅲ期可手術(shù)胃癌患者血漿ctDNA中的RASSF1A和APC甲基化進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ctDNA中RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與臨床預(yù)后相關(guān)性并不大，但術(shù)前ctDNA中APC啟動(dòng)子甲基化的患者具有較高的病死率。術(shù)前ctDNA中SOX17基因甲基化降低了胃癌患者總體生存率[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前ctDNA中MINT2啟動(dòng)子異常甲基化與腹膜播散及腫瘤進(jìn)展相關(guān)；TIMP-3甲基化與患者生存率較差相關(guān)[16]。有研究對(duì)202例胃癌患者術(shù)前不同分期及術(shù)后隨訪ctDNA中XAF1的甲基化情況，結(jié)果顯示XAF1甲基化術(shù)后陰性到陽性的變化與較差的無病生存率相關(guān)[17]。綜上所述，ctDNA中甲基化可預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后。

2.3 DNA擴(kuò)增檢測(cè) 表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)是曲妥珠單抗靶向治療晚期胃癌患者的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。研究表明,HER2基因擴(kuò)增或HER2蛋白過表達(dá)是導(dǎo)致癌癥進(jìn)展的原因，大約20%的晚期胃癌患者存在HER2基因擴(kuò)增或HER2蛋白過表達(dá)[12]。Shoda等[18]用數(shù)字液滴PCR(ddPCR)法對(duì)胃癌患者ctDNA中HER2表達(dá)進(jìn)行了實(shí)時(shí)評(píng)估，術(shù)后隨訪顯示53.84%的患者復(fù)發(fā)時(shí)血漿ctDNA中HER2表達(dá)較高，即使手術(shù)時(shí)診斷為HER2陰性的患者也是如此。因此，通過ddPCR檢測(cè)ctDNA中HER2表達(dá)可為胃癌患者預(yù)后評(píng)估提供新方向。

3 ctDNA在胃癌診療中的應(yīng)用

3.1 篩查及診斷早期胃癌 目前ctDNA作為篩查手段的最大挑戰(zhàn)可能是靈敏度和特異度不高。而近期的一項(xiàng)Meta分析顯示，ctDNA診斷胃癌的靈敏度為62%、特異度為95%。但Meta分析中ctDNA的檢測(cè)方法、基因靶點(diǎn)、患者種族等存在明顯異質(zhì)性，需進(jìn)一步研究以闡明ctDNA在胃癌中的診斷價(jià)值[19]。目前的證據(jù)顯示，ctDNA的靈敏度并不高于傳統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物(癌胚抗原、癌抗原125、癌抗原724等)，ctDNA與傳統(tǒng)蛋白標(biāo)志物結(jié)合診斷的靈敏度為60%～75%[20]。

3.2 預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后 Survivin可抑制細(xì)胞凋亡。胃癌液體活檢顯示，ctDNA中Survivin的表達(dá)可獨(dú)立預(yù)測(cè)患者的生存期，但只有細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的Survivin對(duì)總生存率有顯著影響，而細(xì)胞核表達(dá)的Survivin對(duì)預(yù)后無影響[21]。Cao等[22]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)后血漿ctDNA中Survivin mRNA的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高分化有關(guān)。此外，Rawnaq等[23]對(duì)92例胃腸道腫瘤復(fù)發(fā)的患者血漿ctDNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示微衛(wèi)星DNA雜合性丟失與腫瘤復(fù)發(fā)存在一定的關(guān)聯(lián)，但與總生存期無關(guān)。研究指出ctDNA中膜1型基質(zhì)金屬蛋白酶可作為預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后指標(biāo)[24]。晚期胃癌患者血液ctDNA中程序性死亡-配體1(PD-L1)mRNA表達(dá)高于早期胃癌患者，且PD-L1表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、轉(zhuǎn)移程度及分期有相關(guān)性[25]。

3.3 監(jiān)測(cè)胃癌的耐藥 ctDNA可實(shí)時(shí)反映腫瘤組織的當(dāng)前狀態(tài)，故可定性定量檢測(cè)ctDNA表達(dá)來分析藥物的療效?？诉蛱婺峥捎行е委熢┗?，受體酪氨酸激酶(MET)擴(kuò)增性胃癌，但部分患者仍產(chǎn)生耐藥。Lennerz等[9]通過新一代測(cè)序?qū)Β羝谖赴┗颊遚tDNA中的MET、FGFR2基因進(jìn)行定期突變分析，結(jié)果提示ctDNA中MET的反復(fù)擴(kuò)增和繼發(fā)性突變、FGFR2基因的相對(duì)拷貝數(shù)增加及下游相關(guān)元件的突變等是胃癌產(chǎn)生耐藥的主要原因。40%～50%的胃癌患者ctDNA中存在HER2和(或)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的共擴(kuò)增，可能驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生新的耐藥性[26]。有研究采用靶向捕獲測(cè)序分析了39例早期胃癌患者中的173個(gè)連續(xù)ctDNA樣品，用來分析曲妥珠單抗耐藥機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期胃癌患者中的耐藥基因?yàn)镋GFR和CNV[27]。因此，ctDNA用于胃癌耐藥性的監(jiān)測(cè)。

3.4 監(jiān)測(cè)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā) ctDNA可作為監(jiān)測(cè)殘留腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。Kim等[28]采用全基因組測(cè)序?qū)?5例術(shù)后胃癌患者ctDNA進(jìn)行個(gè)體化腫瘤特異度重排分析，結(jié)果顯示19例患者中發(fā)現(xiàn)腫瘤特異度重排；除此之外，胃癌患者術(shù)前ctDNA陽性與術(shù)后12個(gè)月內(nèi)胃癌復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，提示術(shù)后ctDNA監(jiān)測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)胃癌患者復(fù)發(fā)有重要意義。胃癌術(shù)后ctDNA持續(xù)高水平預(yù)示復(fù)發(fā)的可能[29]。但也有研究表明，胃癌復(fù)發(fā)患者其術(shù)后ctDNA陰性，因此ctDNA并不能作為胃癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[30]。因此，仍需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)ctDNA在胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的作用。

ctDNA為胃癌的基因檢測(cè)、早期診斷、生存預(yù)后、耐藥監(jiān)測(cè)、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面開辟了新的視角。但目前國內(nèi)外研究仍停留在小范圍樣本監(jiān)測(cè)上。因此，仍需更多前瞻性、多中心、大樣本的研究驗(yàn)證ctDNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用價(jià)值。雖然目前ctDNA在臨床中的應(yīng)用有限，但具有通用性，其有可能成為腫瘤診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)之一。