基質(zhì)金屬蛋白酶在寄生蟲疾病中的研究進(jìn)展

葛優(yōu)，古小彬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是一種鋅依賴的內(nèi)源性蛋白酶家族，在進(jìn)化上具有高度保守性，廣泛存在于人類、動(dòng)物、植物和寄生蟲體內(nèi)［1-2］。MMPs通過水解作用降解細(xì)胞外基質(zhì)成分和肽類激素，同時(shí)可激活MMPs 前體分子參與胚胎發(fā)育、血管生成、組織穩(wěn)態(tài)、傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)等多項(xiàng)重要生物學(xué)功能［3-4］。寄生蟲感染宿主機(jī)體時(shí)，一方面宿主可產(chǎn)生MMPs，發(fā)揮破壞自身的物理屏障或組織結(jié)構(gòu)［5］、調(diào)節(jié)寄生蟲疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸［6］、參與免疫逃避［7］和作為寄生蟲病的生物性標(biāo)志物［8］等作用；另一方面，寄生蟲的MMPs具有促進(jìn)寄生蟲入侵宿主［9］和作為寄生蟲病的診斷抗原等［10］作用。由此可見，宿主MMPs 與寄生蟲MMPs 在寄生蟲疾病中具有十分重要的作用。本文從MMPs 的分類和結(jié)構(gòu)、宿主MMPs 和寄生蟲MMPs 在寄生蟲疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 基質(zhì)金屬蛋白酶的分類和結(jié)構(gòu)

根據(jù)作用底物和其結(jié)構(gòu)域的不同組成將MMPs 分為膠原酶（MMP-1-8、-13、-18），明膠酶（MMP-2、-9），間質(zhì)溶解素（MMP-3、-10、-11），基質(zhì)溶解因子（MMP-7、-26），膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（MT-MMPs）（I 型跨膜蛋白：MMP-14、-15、-16、-24；糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白：MMP-17、-25），以及其他基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-12、-19、-20、-21、-22、-23、-27、-28）［11］。

MMPs 家族具有共同的核心結(jié)構(gòu)：1 個(gè)約80個(gè)氨基酸前肽區(qū)，1 個(gè)含鋅的催化結(jié)構(gòu)域及其序列HEXGHXXGXXHS（約170 個(gè)氨基酸），1 個(gè)可變長(zhǎng)度的連接肽（也稱鉸鏈區(qū)）和1個(gè)類血紅素結(jié)構(gòu)域（約200 個(gè)氨基酸）（MMP-7、-23、-26 除外）。前肽區(qū)含有半胱氨酸開關(guān)基序PRCGXPD，其中的半胱氨酸巰基與活性位點(diǎn)Zn2＋螯合，使MMPs 保持其非活性的proMMP 酶原形式，某些MMPs即通過半胱氨酸開關(guān)的裂解及前體被其他蛋白水解酶水解的方式而激活。類血紅素結(jié)構(gòu)域主要作為底物的識(shí)別序列，以及與金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）相互作用的部位。這些典型的結(jié)構(gòu)在MMPs激活和發(fā)揮生理功能過程中起著重要作用［12］。

2 宿主MMPs在寄生蟲疾病中的作用

2.1 MMPs 破壞宿主組織屏障 MMPs 可以降解包括膠原、明膠、糖蛋白、蛋白聚糖、粘連蛋白等在內(nèi)的幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，從而破壞血腦屏障、胎盤屏障、皮膚屏障等組織屏障，有利于寄生蟲入侵和炎性細(xì)胞進(jìn)入感染位點(diǎn)。

2.1.1 MMPs破壞宿主的血腦屏障 廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis）感染引起的嗜酸性腦炎小鼠腦脊液中MMP-9 mRNA、蛋白水平和酶活性均顯著升高，且隨MMP-9 活性的增高腦脊液中的總蛋白含量升高，提示MMP-9 可能破壞血腦屏障的完整性導(dǎo)致腦脊液中蛋白含量升高。后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，感染A.cantonensis小鼠大腦中的緊密連接蛋白claudin-5及IV型膠原蛋白顯著下降，同時(shí)血腦屏障通透性顯著升高，而與野生型小鼠相比，MMP-9基因敲除小鼠大腦中的claudin-5和IV型膠原蛋白明顯升高，且血腦屏障通透性明顯減弱，表明MMP-9 可通過降解緊密連接蛋白和基底膜中的IV 型膠原來破壞血腦屏障的完整性［13］。小鼠感染A.cantonensis后腦脊液中除MMP-9變化外，MMP-12與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）的比值也顯著升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)感染小鼠的MMP-12 與彈性蛋白發(fā)生互作，且能酶解彈性蛋白，同時(shí)MMP-12的含量與彈性蛋白的降解量、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量、血腦屏障的滲透性和蛛網(wǎng)膜下腔的病變程度具有關(guān)聯(lián)性，定位分析發(fā)現(xiàn)MMP-12 分布于蛛網(wǎng)膜下腔的血管壁，表明A.cantonensis感染后，升高的MMP-12 通過降解蛛網(wǎng)膜下腔血管中的彈性蛋白來破壞血腦屏障的完整性［5］。

2.1.2 MMPs破壞宿主的胎盤屏障 剛第弓形蟲（Toxoplasma gondii）感染孕婦后，其體內(nèi)血清和臍帶血清中的MMP-2、-9 蛋白水平和酶活性顯著升高，且MMP-2、-9與纖連蛋白發(fā)生互作。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞感染T.gondii后，細(xì)胞勻漿和上清液中的MMP-2 和MMP-9 含量均升高，同時(shí)細(xì)胞中纖連蛋白碎片顯著增加，免疫沉淀發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9均與纖連蛋白發(fā)生互作，表明弓形蟲感染后升高的MMP-2 和MMP-9可參與纖連蛋白的降解［14］。另外，克式錐蟲（Trypanosoma cruzi）體外感染人胎盤絨毛膜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T.cruzi感染后MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)量和酶活性顯著升高，當(dāng)加入MMPs 抑制劑Doxycycline 時(shí)，能抑制T.cruzi感染引起的組織損傷并降低絨毛膜絨毛內(nèi)的荷蟲量，說明MMP-2和MMP-9 至少部分地參與了T.cruzi感染過程中人絨毛膜組織損傷，對(duì)錐蟲感染具有促進(jìn)作用［15］。

2.1.3 MMPs破壞宿主的皮膚屏障 受嬰兒利什曼原蟲（L.infantum）感染的犬受損皮膚中，其MMP-9 蛋白水平和酶活性顯著升高，同時(shí)觀察到大量成熟的膠原纖維降解，且皮膚的損傷程度與炎癥程度、宿主荷蟲量和成熟膠原纖維降解程度呈正比，表明MMP-9 誘導(dǎo)了真皮膠原成分降解，從而有利于被L.infantum寄生的巨噬細(xì)胞向血管擴(kuò)散，也有利于寄生蟲的全身傳播和持續(xù)性感染的維持［16］。

2.2 MMPs 調(diào)節(jié)寄生蟲疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸 寄生蟲感染過程較慢、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，而MMPs在寄生蟲疾病的漫長(zhǎng)發(fā)展過程中起著重要的作用，最終導(dǎo)致寄生蟲疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

2.2.1 MMPs水平與肝、肺損傷相關(guān) MMPs是膠原代謝和纖維化病理生理過程中的關(guān)鍵酶。肝細(xì)胞與感染恰氏利什曼原蟲（L.chagasi）的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后，肝細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)退行性改變，同時(shí)肝細(xì)胞釋放大量損傷標(biāo)志物——丙氨酸和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，而共培養(yǎng)細(xì)胞提取液和上清液中MMP-9 酶活性增加，添加金屬蛋白酶抑制劑1，10-phenantroline 可顯著減少丙氨酸和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等肝損傷標(biāo)志物的釋放，提示MMP-9可能通過破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)而參與肝損傷［17］。A.cantonensis感染后期會(huì)引起小鼠肺部出現(xiàn)肉芽腫性纖維化，在此過程中MMP-2、-9、-13蛋白水平升高，其升高與纖連蛋白降解發(fā)生的時(shí)間基本一致，并且免疫沉淀顯示MMP-2、-9、-13分別與纖連蛋白發(fā)生互作，表明MMP-2、-9 和-13 可能參與了A.cantonensis誘導(dǎo)的纖維性肉芽腫的纖連蛋白降解，促進(jìn)肺部肉芽腫消退［18］。

2.2.2 MMPs 水平與腦損傷相關(guān) 小鼠感染A.cantonensis后，腦內(nèi)浦肯野細(xì)胞出現(xiàn)變性萎縮和部分消失，小腦中MMP-9 mRNA水平升高，且隨變性程度的加深，MMP-9 蛋白水平和酶活性升高，免疫組化發(fā)現(xiàn)MMP-9存在于浦肯野細(xì)胞中。當(dāng)加入特異性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001后，變性的浦肯野細(xì)胞數(shù)量和MMP-9 酶活性明顯降低，提示MMP-9 的表達(dá)可能與A.cantonensis感染小鼠小腦浦肯野細(xì)胞的變性有關(guān)。豬囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）感染引起腦囊尾蚴病的患者（無癥狀和癲癇癥狀）的血清MMP-2、-9 蛋白水平均升高，其中僅有癲癇癥狀患者的血清MMP-9 呈顯著升高，表明MMP-9 有助于引起腦囊尾蚴病患者癲癇癥狀的出現(xiàn)［19］；C.cellulosae感染形成的腦包囊中MMP-9 mRNA 水平顯著升高，且退化性包囊中的MMP-9 活性顯著高于活動(dòng)性包囊，提示MMP-9與囊腫分期進(jìn)展相關(guān)［20］。

2.2.3 MMPs水平與皮膚病變進(jìn)程相關(guān) 感染巴西利什曼原蟲（L.braziliensis）患者皮膚中的MMP-9 基因表達(dá)顯著高于健康者，且處于潰瘍前階段的L.braziliensis感染患者的外周血單核細(xì)胞經(jīng)可溶性L.braziliensis抗原刺激后，細(xì)胞中MMP-9 蛋白表達(dá)量顯著升高，而TIMP-1表達(dá)下降，但細(xì)胞中MMP-9/TIMP 水平低于典型的潰瘍患者，說明MMP-9 表達(dá)增加和MMP-9/TIMP 失衡與皮膚利什曼病發(fā)展到潰瘍階段密切相關(guān)［6］。

2.3 MMPs 作為寄生蟲疾病的生物學(xué)標(biāo)志L.braziliensis感染引起皮膚利什曼?。↙CL），但其臨床治愈后可能發(fā)展為黏膜利什曼?。∕L）。研究發(fā)現(xiàn)，有LCL病史患者的巨噬細(xì)胞在未感染和感染L.braziliensis后，其上清中MMP-9 活性均較有ML病史的患者低，說明MMP-9可能作為預(yù)測(cè)LCL發(fā)展為ML的生物標(biāo)志物［21］。與健康人相比，感染布氏旋毛蟲（Trichinella britovi）的患者血清中的MMP-9 蛋白量及活性顯著升高，具有明顯腹瀉、肌痛和面部水腫等癥狀的患者血清中的MMP-9蛋白量較輕微臨床癥狀患者更高，提示MMP-9可作為旋毛蟲病患者臨床癥狀的標(biāo)志物［22］。

2.4 宿主MMPs 有利于寄生蟲的發(fā)育 蚊子吸食感染瘧原蟲（Plasmodium berghei）的小鼠血液后，蚊子MMP-1表達(dá)顯著升高，但用dsRNA干擾蚊子MMP-1后再吸食P.berghei感染小鼠的血液，發(fā)現(xiàn)干擾組蚊子體內(nèi)的瘧原蟲卵囊數(shù)較未干擾組顯著減少，表明蚊子MMP-1 有利于蚊子體內(nèi)瘧原蟲卵囊的形成［23］。

3 寄生蟲MMPs與寄生蟲疾病

寄生蟲感染宿主體時(shí)，可引起宿主MMPs 發(fā)生變化，同時(shí)寄生蟲亦存在MMPs，但有關(guān)寄生蟲MMPs 的研究較少。目前，僅有少量關(guān)于棘顎口線蟲（Gnathostoma spinigerum）和福氏耐格里阿米巴原蟲（Naegleria fowleri）的MMPs研究報(bào)道。

以G.spinigerum重組MMP蛋白建立的免疫印跡法（WB）和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法（Dot-ELISA）對(duì)健康個(gè)體、棘顎口線蟲病患者及其他寄生蟲感染患者的血清進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)WB和Dot-ELISA 具有較高的敏感性（均為100%）和特異性（WB為94.7%；Dot-ELISA為96.1%）［10］，表明MMP蛋白可作為棘顎口線蟲病的診斷抗原［24］。N.fowleri感染人工基底膜2 h后，基底膜復(fù)合材料被破壞，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體侵入基底膜中，且在基底膜存在的情況下，N.fowleriMMPs 蛋白的水解活性增加，當(dāng)使用抑制劑1，10-Phenanthroline后，N.fowleriMMPs 活性及N.fowleri滋養(yǎng)體進(jìn)入人工基底膜的數(shù)量顯著受抑制，表明滋養(yǎng)體的活力和入侵至少部分依賴于蟲體MMPs蛋白的水解活性［9］。

4 總結(jié)

綜上所述，在寄生蟲感染中，宿主與寄生蟲的MMPs 在寄生蟲疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都起著舉足輕重的作用。但目前主要集中于部分原蟲和蠕蟲感染后宿主MMPs 的研究，仍有大量其他寄生蟲感染的宿主MMPs研究處于空白。值得注意的是，相對(duì)于宿主MMPs的研究而言，對(duì)寄生蟲來源的MMPs 相關(guān)功能的研究還十分匱乏，且宿主和寄生蟲二者產(chǎn)生的MMPs之間是否存在相互作用也有待探究。