三顆針提取物含量測(cè)定及其對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究

格桑卓嘎，四朗玉珍，拉巴次旦，吳金措姆，班旦

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

三顆針為傳統(tǒng)的中藥、民間藥，用藥歷史悠久、療效廣泛，常用來替代黃柏，主治濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、癰腫瘡毒等，《中國(guó)藥典》規(guī)定其來源為小檗科小檗同屬多植物的干燥根［1］。全球有500 多種，我國(guó)有250 多種，主要分布在云南、西藏、四川三省地區(qū)，其中四川西部、阿壩州、涼山州、川南一帶的三顆針產(chǎn)量豐富且較集中［2］。本屬幾乎都含有極強(qiáng)生物活性的異喹啉類生物堿，其含量與植物的產(chǎn)地、種類、部位等有很大關(guān)系，相關(guān)研究多通過高效液相色譜法（HPLC）以生物堿類化合物為指標(biāo)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［3］。

金黃色葡萄球菌是一種常見的人獸共患病原菌，可引起人和動(dòng)物多種感染性死亡，包括敗血癥、心內(nèi)膜炎和膿毒癥等?？股氐氖褂眉盀E用催生并富集了耐藥性菌株，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）感染已成為最難解決的感染性疾患，關(guān)鍵是其對(duì)許多抗生素有多重交叉耐藥［4］。α-溶血素（Hla）是一種重要的外分泌蛋白，大量研究表明Hla 是金葡菌致病過程中最重要的毒力因子，尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎［5］。

產(chǎn)地是影響中藥材質(zhì)量的主要因素之一［6］，本研究通過HPLC 法測(cè)定了川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥铩⒋继崛∥镏械乃幐鶋A、巴馬汀、小檗堿含量并進(jìn)行比較，分析三顆針?biāo)幉脑诓煌a(chǎn)地的含量變化規(guī)律，為開發(fā)利用三顆針植物資源提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種 金黃色葡萄球菌USA300。

1.2 藥材 川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末。

1.3 試劑 鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品購(gòu)自上海某生物科技中心；磷酸、三乙胺購(gòu)自成都某耗材試劑公司；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸（色譜純），三乙胺（色譜純），TSB、TSA培養(yǎng)基購(gòu)自青島某生物技術(shù)公司。

1.4 儀器 高效液相色譜儀，電子分析天平，pH計(jì)，超凈工作臺(tái)，手提式高壓滅菌器，電熱恒溫培養(yǎng)箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SZ-9327自動(dòng)三重純水蒸餾器等。

2 方法

2.1 三顆針?biāo)?、醇提取物的制?取川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末40 g，以料液比1 g∶10 mL 浸泡30 min后加熱提取2 次，每次1 h。取粉碎的川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末40 g，用甲醇以料液比1 g∶10 mL靜置3d，提取2次。分別合并兩次提取液，以4000 r/min離心5 min，取上清液，旋蒸濃縮至水提液體積的1/20左右，冷凍干燥后備用。

2.2 HPLC測(cè)定三顆針提取物的含量

2.2.1 色譜條件 使用BDS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)流動(dòng)相：0.05 mol/L 磷酸/三乙胺∶乙腈（76∶24，pH＝2.4），檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm，每次進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品，配制成濃度為80、40、20、10、4 μg/mL（鹽酸小檗堿）以及40、20、10、4、2 μg/mL（鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬?。┑膶?duì)照品溶液。

2.2.3 線性范圍測(cè)定 精密吸取各濃度鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、鹽酸藥根堿對(duì)照品溶液、鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液，分別以10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取4 μg/mL鹽酸小檗堿、2 μg/mL 鹽酸藥根堿、2 μg/mL 鹽酸巴馬汀進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定，同時(shí)記錄平均峰面積、RSD值。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 分析測(cè)定，同時(shí)記錄鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的平均峰面積、RSD值。

2.2.6 樣品含量測(cè)定 分別取川產(chǎn)、藏產(chǎn)水提和醇提粉末各0.04 mg，用甲醇定容于5 mL 容量瓶中，搖勻，再取醇提樣品2.5 mL于5 mL容量瓶中，作為樣品溶液。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，重復(fù)3次，根據(jù)平均峰面積計(jì)算鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的含量。

2.3 三顆針提取物亞抑菌濃度對(duì)金黃色葡萄球菌的影響

2.3.1 藥物貯存液的制備 用DMSO（二甲基亞砜）將川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)嵛锖痛继嵛锓謩e配成500 mg/mL 生藥濃度，分裝于5 mL滅菌離心管，用封口膜封口，置4℃儲(chǔ)藏備用。

2.3.2 藥物最小抑菌濃度的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定三顆針對(duì)金葡菌USA300的最低抑菌濃度（MIC），其中第1孔至第8孔三顆針的質(zhì)量濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL；第9 孔為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)基中只加菌液；第10 孔為溶劑對(duì)照，培養(yǎng)基中只加二甲基亞砜；第11 孔為空白對(duì)照。37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察以無(wú)菌生長(zhǎng)、澄清透明的質(zhì)量濃度為MIC，重復(fù)測(cè)三次。

2.3.3 亞抑菌濃度下菌株生長(zhǎng)曲線的繪制 金黃色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 搖床過夜培養(yǎng)16 h 至OD600為0.1，5 000 r/min 離心10 min，用生理鹽水重懸。將菌懸液與TSB 培養(yǎng)基、藥液混合，稀釋成OD600約0.1 的菌懸液，使提取物的終濃度分別為其亞抑菌濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培養(yǎng)基、菌液為對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、8、12、24 h 測(cè)OD600值，記錄并整理數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3.4 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物被膜形成 金黃色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 搖床培養(yǎng)16 h，按1∶100 的比例稀釋菌懸液。將菌懸液與TSB 培養(yǎng)基、藥液混合，加入96孔板（200 μL/孔），使提取物的終濃度分別為其亞抑菌濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培養(yǎng)基、菌液為對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24、48 h，取板，重復(fù)三次取平均值。

采用改良后的96孔微孔板BF定量檢測(cè)方法檢測(cè)：用滅菌后的PBS 洗滌3次，除去雜質(zhì)和浮游菌；取200 μL 甲醇固定15 min 后舍棄甲醇溶液，晾干培養(yǎng)板，每孔加200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，用蒸餾水洗去多余的染色液，晾干；每孔加200 μL 33%冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD595nm值，重復(fù)三次取平均值。

2.3.5 金葡菌溶血能力的測(cè)定 將金黃色葡萄球菌接種于TSB 培養(yǎng)基，于37 ℃200 r/min 搖床培養(yǎng)16 h，按100 倍稀釋至新鮮培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）三顆針提取物于4 mL 離心管中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min）16 h，然后以10 000 r/min 離心5 min，收集培養(yǎng)物上清。將400 μL 培養(yǎng)物上清和400 μL 5%脫纖維兔血反應(yīng)體系混勻，然后置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育20 min，10 000 r/min 離心5 min，收集反應(yīng)體系上清并檢測(cè)樣品的吸光度值（OD543nm），重復(fù)三次取平均值。

以菌液為對(duì)照組，設(shè)定為100%溶血；以TSB為空白組，設(shè)定為0%溶血。每組樣品的溶血比例與對(duì)照組作對(duì)比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；組間比較采用方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異顯著；用Prism 8.0 對(duì)圖像進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為Y＝30 975X+15 072，Y＝32 395X+30 359，Y＝32 87X+1 187.6。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在4～90μg/mL（r＝0.9995），鹽酸藥根堿在2～50 μg/mL（r＝0.999 7），鹽酸巴馬汀在2～50 μg/mL（r＝0.999 6）范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn) 鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的精密度見表1。由表1 可見，三者的RSD均小于2%，說明儀器的精密性良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見表2、表3。川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥?、醇提取物樣品?2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 三顆針提取物樣品含量的測(cè)定 結(jié)果見表4、表5。三顆針?biāo)崛∥镏兴幐鶋A、巴馬汀、小檗堿的含量分別為0.476 1、0.436 9、4.792 mg/g（川產(chǎn)）和0.403 2、2.641 2、4.341 3 mg/g（藏產(chǎn)）；三顆針醇提取物中藥根堿、巴馬汀、小檗堿的含量分別為0.723、0.631 8、7.945 3 mg/g（川產(chǎn)）和0.768 8、5.115 7、8.067 6 mg/g（藏產(chǎn)）。

3.5 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥飳?duì)金黃色葡萄球菌的MIC 均為25 mg/mL，川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC均為12.5 mg/mL（見表6）。

3.6 三顆針在亞抑菌濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響 三顆針的抑菌作用具有濃度依賴性，1/2MIC時(shí)仍能在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，1/4MIC仍有較強(qiáng)的抑菌作用，但是比1/2MIC 的抑菌能力弱，1/8MIC濃度時(shí)的抑菌作用不明顯。

表2 三顆針?biāo)崛∥锓€(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表3 三顆針醇提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 三顆針?biāo)崛∥锖繙y(cè)定結(jié)果 mg/g

表5 三顆針醇提取物含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

表6 三顆針提取物最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3.7 三顆針對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響 由圖1、圖2 可知，亞抑菌濃度下的三顆針提取物均對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300生物被膜的形成有影響，在24 h 時(shí)差異極顯著，在48 h 時(shí)1/4MIC 和1/8MIC 的 藥效開始降低。

3.8 三顆針對(duì)金黃色葡萄球菌α-溶血素表達(dá)的影響 隨著濃度不斷增加，顏色逐漸由紅色變成無(wú)色，川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥?、醇提取物?/2MIC時(shí)顏色達(dá)到最淺，接近空白組的顏色（P＜0.01）。川產(chǎn)、藏產(chǎn)醇提取物在不同濃度下可以使金葡菌的溶血能力下降，對(duì)α-溶血素有一定的抑制作用。醇提取物對(duì)USA300的抑制作用比水提取物更強(qiáng)，且川產(chǎn)三顆針醇提取物的抑制效果最好（圖3）。

4 討論

對(duì)三顆針化學(xué)成分研究較多的是小檗堿、藥根堿、巴馬汀、小檗胺等季銨類生物堿［7］，因此多通過HPLC 法同時(shí)測(cè)定幾種生物堿含量，以綜合評(píng)價(jià)三顆針的質(zhì)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明三顆針醇提取物中的3 種生物堿（藥根堿、巴馬汀和小檗堿）含量均高于水提取物，MIC試驗(yàn)結(jié)果表明醇提取物比水提取物具有更明顯的抑菌效果，說明甲醇更容易提取三顆針中的有效抑菌物質(zhì)。川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針提取物中，含量最高的是小檗堿；藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥?、醇提取物中的巴馬汀含量都比川產(chǎn)的高。

圖1 三顆針提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜24 h的消除作用

圖2 三顆針提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜48 h的消除作用

圖3 三顆針提取物與USA300培養(yǎng)物上清對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血作用

本試驗(yàn)表明三顆針醇提取物對(duì)USA300 的MIC（25 mg/mL）比水提取物（12.5 mg/mL）更高，抑菌效果更顯著。抗菌活性試驗(yàn)表明，在三顆針有效活性濃度范圍內(nèi)，1/8MIC對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)幾乎沒什么影響，1/4MIC、1/2MIC 對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。生物被膜的抑制和清除試驗(yàn)表明，三顆針對(duì)USA300 24 h 和48 h的生物被膜均具有抑制和清除作用，且高劑量的清除作用明顯，低劑量時(shí)USA300 呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

金黃色葡萄球菌感染后會(huì)產(chǎn)生多種毒力因子，特別是α-溶血素能誘導(dǎo)金葡菌產(chǎn)生細(xì)胞自噬反應(yīng)，引起強(qiáng)烈的組織損傷，破壞宿主的免疫系統(tǒng)。本試驗(yàn)表明，隨著三顆針提取物濃度的增加，金葡菌溶血能力呈逐漸下降的趨勢(shì)，亞抑菌濃度下也能抑制致病菌分泌α-溶血素。

5 結(jié)論

三顆針提取物對(duì)MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300 有顯著的抑菌作用，且對(duì)USA300 生物被膜的形成和α-溶血素有良好的抑制作用，但作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。