礬根葉柄和葉片不定芽高效再生體系優(yōu)化

孫 翊,殷麗青,張永春*,庹曉慶,付正龍,田 莉,3

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所,上海201403;2 上海安康園藝工程有限公司,上海201111;3長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,荊州434025)

礬根(Heucheraspp.)是虎耳草科礬根屬(Heuchera)植物的統(tǒng)稱,原產(chǎn)于美洲中部,為宿根花卉類群。其花葉兼美,葉色亮麗且顏色豐富,是不可多得的新優(yōu)彩葉地被觀賞植物,可作為邊飾、叢植、地被、盆栽等材料應(yīng)用[1],也可用于土壤修復(fù)[2],在我國花卉市場(chǎng)上關(guān)注度不斷上升。 目前,大部分礬根品種以無性繁殖方式進(jìn)行種苗生產(chǎn)[3]。 分株繁殖和扦插繁殖周期長、繁殖系數(shù)低、受季節(jié)影響大[4]。 組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)今規(guī)?；庇\根種苗的主要方法。 礬根的組培快繁技術(shù)絕大部分以芽作為起始擴(kuò)繁的材料[5-8],存在取材困難、數(shù)量較少、對(duì)母株破壞性大等問題。 已有的研究顯示,礬根葉柄和葉片經(jīng)誘導(dǎo)均可獲得愈傷組織,然而兩者的誘導(dǎo)率不高,分別為19%和11%[9]。 利用礬根葉柄作為起始擴(kuò)繁材料建立礬根離體再生體系,不定芽分化率較高,達(dá)81.25%[10],然而該方法需經(jīng)過愈傷組織階段,且期間需要更換培養(yǎng)基,操作較為復(fù)雜。

植物高效再生體系的建立是成功進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ),能夠?yàn)樯钊腴_展植物遺傳機(jī)理研究和品質(zhì)改良提供重要支撐[11]。 本研究以礬根無菌苗的葉柄和葉片作為外植體,通過對(duì)培養(yǎng)條件和植物生長調(diào)節(jié)劑濃度進(jìn)行篩選,直接誘導(dǎo)并分化獲得不定芽,旨在建立一種更為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且有效的礬根直接再生體系,為礬根種苗的快速繁殖及新品種的培育奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以礬根‘巴黎’和‘閃秋’無菌苗的葉柄和葉片為外植體,將葉柄剪成0.8—1 cm 長,葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm,用于后續(xù)接種。

1.2 試驗(yàn)方法

將外植體接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo),每皿接種12 個(gè)外植體。 培養(yǎng)基成分:以MS 為基本培養(yǎng)基,均添加3%蔗糖、0.6%瓊脂粉、0.1 mg∕L 萘乙酸(Naphthylacetic acid,NAA),并分別添加不同濃度的噻重氮苯基脲(Thidiazuron,TDZ)和6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)。 所有培養(yǎng)基pH 均為5.8,并經(jīng)121 ℃、0.11 MPa 的高溫、高壓滅菌20 min。 培養(yǎng)室溫度為(24 ±2) ℃,先進(jìn)行暗培養(yǎng),再轉(zhuǎn)移至光照強(qiáng)度為(35 ±3)μmol∕(m2·s),光照12 h∕黑暗12 h 條件下培養(yǎng)。

1.2.1 暗培養(yǎng)時(shí)間的篩選

將外植體接種于MS+0.2 mg∕L TDZ+0.1 mg∕L NAA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),暗培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置0 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 共5 個(gè)處理,之后進(jìn)行光照培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)4 次,接種50 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽再生率和不定芽數(shù)。 不定芽再生率=分化獲得有效不定芽的外植體數(shù)∕接種的外植體數(shù)×100%;不定芽數(shù)為每皿12 個(gè)外植體總計(jì)分化獲得的有效不定芽數(shù)量。

1.2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度的篩選

以MS +0.1 mg∕L NAA 為基礎(chǔ),分別添加不同質(zhì)量濃度的TDZ(0.1 mg∕L、0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L)或者6-BA(0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、2.0 mg∕L)配制培養(yǎng)基,將外植體接種于其上進(jìn)行培養(yǎng),暗培養(yǎng)時(shí)間為21 d,之后進(jìn)行光照培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)4 次,30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽再生率和不定芽數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和多重比較分析(Duncan),顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)礬根葉柄和葉片不定芽再生的影響

在不同的暗培養(yǎng)時(shí)間條件下,礬根‘巴黎’和‘閃秋’的葉片和葉柄均能夠產(chǎn)生不定芽,不定芽再生率和不定芽數(shù)在處理間具有明顯差異(表1 和表2)。 隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的增加,礬根不定芽再生率和不定芽數(shù)均呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì),均在暗培養(yǎng)21 d 時(shí)達(dá)到峰值。 而品種間具有一定的差異性,‘巴黎’的再生情況優(yōu)于‘閃秋’,表現(xiàn)為前者的不定芽再生率和不定芽數(shù)總體高于后者。 此外,在不同外植體材料間,‘巴黎’葉柄的再生情況優(yōu)于葉片,而‘閃秋’葉片的再生情況優(yōu)于葉柄。 ‘巴黎’的不定芽再生率最高為56.25%,‘閃秋’為45.83%;‘巴黎’的不定芽數(shù)最高為9.75 個(gè),‘閃秋’為7.75 個(gè)。

表1 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)礬根葉片不定芽再生的影響Table 1 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of Heuchera spp.

表2 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)礬根葉柄不定芽再生的影響Table 2 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)礬根葉柄和葉片不定芽再生的影響

以礬根‘巴黎’和‘閃秋’葉片和葉柄作為外植體,在各自適宜培養(yǎng)基的條件下(葉片為MS+0.5 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA,葉柄為MS+0.2 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA),光照培養(yǎng)10 d 左右(即培養(yǎng)30 d 左右),外植體傷口附近均能夠出現(xiàn)淺綠色的凸起,表明外植體已經(jīng)開始進(jìn)行不定芽的分化;經(jīng)過50 d 左右的培養(yǎng),分化獲得的不定芽形態(tài)十分明顯(圖1、圖2)。

由表3 可知,隨著植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的增加,礬根葉片不定芽再生率和不定芽數(shù)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),低濃度處理效果優(yōu)于高濃度。 而6-BA 的處理效果要優(yōu)于TDZ,前者處理的‘巴黎’平均不定芽再生率為59.38%,‘閃秋’為67.71%,遠(yuǎn)高于后者的22.92%和28.13%。 兩個(gè)品種的葉片再生不定芽情況均在0.5 mg∕L 6-BA 的培養(yǎng)基上表現(xiàn)最佳,礬根的不定芽再生率達(dá)到最高,‘巴黎’為62.50%,‘閃秋’為75.00%。 與此同時(shí),不定芽數(shù)也最多,分別為20.50 個(gè)和21.25 個(gè)。 綜上,MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是礬根葉片產(chǎn)生不定芽的最適培養(yǎng)基。

表3 不同濃度TDZ 與6-BA 對(duì)礬根葉片不定芽再生的影響Table 3 Effects of different concentrations of TDZ and 6-BA on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of H. spp.

由表4 可知,隨著TDZ 及6-BA 濃度的增加,礬根葉柄不定芽再生率和不定芽數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 且6-BA 的處理效果要優(yōu)于TDZ,前者處理的‘巴黎’平均不定芽再生率為81.25%,‘閃秋’為59.90%,遠(yuǎn)高于后者處理的34.38%和14.06%。 在0.2 mg∕L 6-BA 的培養(yǎng)基上,礬根‘巴黎’和‘閃秋’的葉柄再生不定芽情況表現(xiàn)最佳,分別為89.58%和77.08%,不定芽數(shù)也最多,分別為28.50 個(gè)和12.50 個(gè)。 ‘巴黎’的再生情況略優(yōu)于‘閃秋’。 綜上,MS +0.2 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是礬根葉柄產(chǎn)生不定芽的最適培養(yǎng)基。

表4 不同濃度TDZ 與6-BA 對(duì)礬根葉柄不定芽再生的影響Table 4 Effects of TDZ and 6-BA concentrations on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

3 討論

不同基因型礬根屬植物愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。 紅花礬根(H.sanguinea)葉柄在MS +4.40 μmol∕L 6-BA +0.19 μmol∕L NAA 培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)90%[12];而礬根(H.micrantha)葉柄在MS+6-BA 0.5 mg∕L 的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率僅為19%[9]。 田莉等[10]以礬根‘巴黎’葉柄作為起始擴(kuò)繁材料,經(jīng)過60 d 左右的誘導(dǎo)及分化培養(yǎng),獲得的不定芽分化率為81.25%,相對(duì)較低,且操作復(fù)雜,污染幾率大。 本文建立的方法適用于兩種不同的礬根品種,其外植體在同一種培養(yǎng)基上經(jīng)過50 d 左右的培養(yǎng)可獲得不定芽,是今后進(jìn)行礬根屬植物不定芽再生研究的首選方法之一。

光照對(duì)植物器官的形成具有誘導(dǎo)作用,外植體在暗培養(yǎng)下進(jìn)行脫分化,在光照培養(yǎng)下進(jìn)行再分化,最終可形成愈傷組織和不定芽[13-14]。 在蝴蝶蘭、棗樹等的研究中發(fā)現(xiàn),適當(dāng)長度的暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生[15-16]。 本研究結(jié)果表明,暗培養(yǎng)時(shí)間過短或過長均不利于礬根不定芽再生,21 d 是礬根不定芽再生的最佳暗培養(yǎng)時(shí)間。

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度與配比是調(diào)節(jié)外植體形成愈傷組織或不定芽的重要影響因素[17-18]。 田莉等[10]研究顯示,低濃度的NAA 更適宜礬根‘巴黎’愈傷組織的誘導(dǎo),且在MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.5 mg∕L NAA 培養(yǎng)基上僅產(chǎn)生愈傷組織,無法分化獲得不定芽[10]。 鄒清成等[19]利用礬根葉片作為外植體,在MS+2.0 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得愈傷并進(jìn)一步形成不定芽,分化率為68.67%,相對(duì)較低。 礬根‘巴黎’和‘閃秋’在MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA 培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)率不高的同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)一定程度的玻璃化現(xiàn)象,會(huì)對(duì)后續(xù)獲得種苗的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。 本研究結(jié)果表明,多種植物生長調(diào)節(jié)劑的復(fù)合使用,能夠達(dá)到在同一種培養(yǎng)基上完成脫分化和再分化過程的效果,使礬根獲得較高的不定芽再生率。 培養(yǎng)基中添加的NAA 能夠與細(xì)胞分裂素相互作用促進(jìn)礬根愈傷組織的誘導(dǎo);添加TDZ 或6-BA 能夠有效促進(jìn)礬根不定芽的分化。 但是,若植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過低,則不能夠有效促進(jìn)外植體再生,濃度過高,則易產(chǎn)生玻璃化問題[1]。 本研究建立的礬根不定芽再生方法,利用含有較低濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基,結(jié)合光照條件的變化(21 d 暗培養(yǎng)和30 d 光照培養(yǎng)),葉柄和葉片兩種外植體上均再生出優(yōu)質(zhì)的礬根不定芽。 該方法在獲得較高不定芽再生率的同時(shí)解決了不定芽的玻璃化問題,并可減少變異產(chǎn)生,不定芽再生效果良好。

綜上,本研究以葉柄和葉片作為外植體,通過開展不同暗培養(yǎng)時(shí)間以及不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)礬根不定芽再生影響的研究,建立了一種取材范圍更廣且更為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且有效的礬根不定芽再生方法。 該方法可以克服以芽作為起始擴(kuò)繁材料的局限,進(jìn)一步擴(kuò)大了外植體取材范圍;提高礬根的不定芽再生率(礬根‘巴黎’高達(dá)89.58%);在同一種培養(yǎng)基上經(jīng)誘導(dǎo)和分化直接再生獲得不定芽,有效簡(jiǎn)化操作并節(jié)約生產(chǎn)成本。 同時(shí),優(yōu)化了礬根不定芽高效再生體系,能夠?yàn)榉N苗的快速繁殖、新品種培育以及利用基因工程手段進(jìn)行性狀的改良提供良好的技術(shù)支持。 本研究顯示,礬根葉柄比葉片更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽,但在相同外植體個(gè)數(shù)下獲得的不定芽數(shù)量在不同品種間具有差異。 針對(duì)特定礬根品種,可對(duì)其葉柄和葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽數(shù)量進(jìn)行比較,從而確定該品種不定芽再生的最佳外植體材料。