基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生作用機(jī)制

吳丹丹，國倩倩，高毅潔，王曼曼，賈冬冬，楊睿，張冬梅，朱珂

論著·中醫(yī)藥信息學(xué)

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生作用機(jī)制

吳丹丹，國倩倩，高毅潔，王曼曼，賈冬冬，楊睿，張冬梅，朱珂

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的活性成分，并預(yù)測其可能機(jī)制。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索活血益氣方組方藥物黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍、紅花，篩選口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18的藥物有效成分及相應(yīng)靶點；檢索OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到心肌梗死后血管新生相關(guān)靶點；將活血益氣方靶點與心肌梗死后血管新生靶點的交集輸入String數(shù)據(jù)庫，獲得靶點蛋白相互作用關(guān)系，根據(jù)蛋白相互作用密切度得到核心靶點，使用Cytoscape3.7.0軟件可視化核心靶點-藥物成分相互作用網(wǎng)絡(luò)，對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的核心成分；使用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析。篩選得到活血益氣方有效活性化合物148個，相應(yīng)靶點275個，疾病相關(guān)靶點418個，藥物與疾病的交集靶點78個；蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，與其他靶點關(guān)系密切的靶點為STAT3、JUN、AKT1；GO生物功能分析和KEGG通路富集分析得到447條生物功能條目及101條信號通路?；钛鏆夥娇赡芡ㄟ^多成分、多靶點、多通路實現(xiàn)促進(jìn)心肌梗死后血管新生的作用。

活血益氣方；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；心肌梗死；血管新生

在缺血性心臟病中，血管新生是缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)心肌缺血區(qū)的“自我搭橋”[1]，完成血管床的再建，對患者的治療及預(yù)后意義重大。缺血性心臟病患者在缺血缺氧環(huán)境刺激下，會自發(fā)生成新的血管以改善其缺血缺氧狀況[2]，但病理條件下的血管新生很微弱，不足以改善癥狀。外源性干預(yù)促進(jìn)缺血區(qū)血管新生能夠改善缺血區(qū)的病理狀況，增加缺血區(qū)的新生血管，在一定程度上改善缺血區(qū)的血供，從而緩解癥狀[3]。近年來，生長因子、基因和細(xì)胞移植等外源性干預(yù)促血管新生治療缺血性疾病的基礎(chǔ)研究取得了一定進(jìn)展，但臨床研究結(jié)果并不理想。因此，在缺血性心臟病中，尋找更為有效和安全的藥物是促血管生成的關(guān)鍵問題。

活血益氣方依據(jù)活血益氣法組方，由黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍、紅花6味中藥組成，臨床應(yīng)用顯示其可防治心肌梗死后心力衰竭，動物實驗研究顯示該方可逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu)[4-5]。本課題組前期研究表明，活血益氣方可促進(jìn)急性心肌梗死模型大鼠心肌梗死邊緣區(qū)血管新生[6-12]。前期研究顯示，活血益氣方具有促進(jìn)心肌梗死后血管新生的藥理作用，然而其作用機(jī)制尚不清楚。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點的特點。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集合了數(shù)據(jù)庫檢索、靶點功能分析、靶點通路富集分析等多種研究手段，從整體角度展現(xiàn)中藥成分靶點間的相互作用關(guān)系，在不拆分中藥各成分的前提下對中藥可能的作用機(jī)制進(jìn)行分析[13-14]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的作用機(jī)制和靶點進(jìn)行預(yù)測和分析，為該方的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及靶點獲取

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）依次檢索黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍、紅花，設(shè)定參數(shù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，獲得相應(yīng)藥物的化合物成分。在數(shù)據(jù)庫中輸入化合物成分，獲得其對應(yīng)的靶點。

1.2 疾病靶點收集

進(jìn)入OMIM數(shù)據(jù)庫（http://omim.org/），點擊“Gene Map”，以“myocardial infarction angiogenesis”為檢索詞進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果下載為excel文件。進(jìn)入GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“myocardial infarction angiogenesis”為檢索詞進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果下載為excel文件。將上述檢索結(jié)果進(jìn)行合并，獲得心肌梗死后血管新生疾病靶點。

1.3 藥物與疾病靶點映射

將活血益氣方有效活性成分作用靶點與心肌梗死后血管新生疾病靶點取交集，得到活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的靶點蛋白。進(jìn)入UniProtKB數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uniprot/），輸入靶點蛋白，Organism選擇“Homo sapiens”，獲得蛋白靶點基因名稱。

1.4 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

進(jìn)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇“Multiple proteins”，輸入靶點蛋白，物種選擇“Homo sapiens”，在設(shè)定中將互動得分設(shè)置為最高置信度0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點，獲得活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生蛋白靶點的相互作用圖及作用結(jié)果。對蛋白相互作用結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)密切程度找出核心靶點。使用Cytoscape3.7.0軟件可視化活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的核心靶點及其對應(yīng)的藥物成分網(wǎng)絡(luò)，使用NetworkAnalyzer插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到核心靶點及其對應(yīng)成分的拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)。

1. 5 GO分析和KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的靶點蛋白進(jìn)行分析，選擇“Functional Annotation”，將靶點蛋白基因名稱輸入Uplode中Enter Gene List，Select Identifier選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type設(shè)為“Gene List”，List中Select species選擇“Homo sapiens”，Background中Select a background設(shè)置為“Homo sapiens”，在Gene_Ontology分析中選擇“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT”進(jìn)行分析，在Pathways分析中選擇“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分及靶點

通過TCMSP獲得各藥物有效成分，包括黃芪20個、黨參21個、丹參65個、川芎7個、赤芍29個、紅花22個，合并共有成分，得到148個有效活性化合物。通過TCMSP獲得有效成分的靶點蛋白，合并共有靶點，得到275個藥物成分靶點。

2.2 藥物治療疾病靶點

分別通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫得到心肌梗死后血管新生相關(guān)靶點415、3個，合并靶點并將其與活血益氣方成分靶點蛋白取交集，獲得78個作用靶點。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖1，相互作用關(guān)系緊密的前10個蛋白靶點見圖2。STAT3、JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、MAPK8、MAPK13、VEGFA、IL6等靶點蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用關(guān)系緊密。

采用Cytoscape3.7.0軟件對核心靶點及其對應(yīng)的藥物成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可視化構(gòu)建結(jié)果見圖3，對該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見表1。節(jié)點的自由度表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點直接作用的節(jié)點數(shù)目，自由度越大則生物學(xué)重要性越強。活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的核心靶點對應(yīng)的核心成分主要有l(wèi)uteolin（槲皮素）、quercetin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、baicalein（黃芩素）等。

圖1 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖2 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)核心靶點蛋白

圖3 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生核心靶點與成分網(wǎng)絡(luò)

表1 活血益氣方治療心肌梗死后血管新生核心靶點成分拓?fù)浞治?/p>

名稱最短路徑長度接近中心性自由度類型 luteolin0.187 030.409 8418mol quercetin0.187 030.409 8412mol JUN0.586 380.454 5411gene AKT10.075 430.333 339gene TNF0.208 120.342 468gene TP530.045 330.316 458gene MAPK140.490 000.342 468gene IL60.027 520.308 646gene MAPK15.56E-040.301 205gene kaempferol0.151 620.384 624mol baicalein0.002 980.263 164mol cryptotanshinone0.080 000.263 162mol formononetin0.453 330.396 822mol tanshinone iia0.018 850.333 332mol beta-sitosterol00.316 462mol beta-carotene0.014 880.333 332mol paeoniflorin0.004 280.263 162mol STAT300.210 081gene MAPK800.280 901gene isorhamnetin00.257 731mol 7-O-methylisomucronulatol00.257 731mol Calycosin00.257 731mol 7-Methoxy-2-methyl isoflavone00.257 731mol glycitein00.257 731mol 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- 5- (3-hydroxypropyl)-7-methoxy-3- benzofurancarboxaldehyde00.257 731mol Myricanone00.257 731mol

2.4 藥物作用靶點GO分析

活血益氣方作用靶點GO分析共獲得＜0.05的條目447條，包括分子功能61條、生物過程348條和細(xì)胞組成38條，前10位結(jié)果見圖4?；钛鏆夥酱龠M(jìn)心肌梗死后血管新生的作用靶點在分子功能中富集于酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、同一蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性及配體激活序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)均聚活性、類固醇激素受體活性、蛋白酶結(jié)合等條目；在生物過程中富集于基因表達(dá)的正調(diào)控、低氧反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、一氧化氮合成過程的正向調(diào)節(jié)、缺氧的細(xì)胞反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、正調(diào)控血管新生、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)及DNA模板、炎癥反應(yīng)等條目；在細(xì)胞組成中富集于細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)、膜筏、胞質(zhì)溶膠、小窩、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞表面、質(zhì)膜、質(zhì)膜外側(cè)面、線粒體等條目。

圖4 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生靶點GO富集分析（前10位）

2.5 藥物作用靶點KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析共獲得＜0.05的通路101條?；钛鏆夥酱龠M(jìn)心肌梗死后血管新生蛋白靶點富集于TNF信號通路、癌癥通路、乙肝、恰加斯病、弓形蟲病、大腸癌、蛋白聚糖在癌癥中、結(jié)核、HIF-1信號通路、非酒精性脂肪性肝病等通路，前10位見表2，氣泡圖見圖5。圖中點的大小表示通路富集的基因數(shù)目，點越大表示富集的基因數(shù)目越多；點的顏色表示值，點越紅表示富集的顯著性越高。

表2 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生KEGG通路及關(guān)聯(lián)基因

信號通路基因數(shù)目P值基因名稱 TNF信號通路201.15E-18PIK3CG，IL6，TNF，CCL2，PTGS2，MMP9，NFKBIA，MMP3，CXCL10，AKT1，VCAM1，MAPK1，CASP3，CASP7，JUN，MAPK14，CASP8，IL1B，MAPK8，SELE 癌癥通路281.61E-15PPARD，PTGS2，MMP9，PPARG，NFKBIA，MMP2，TGFB1，MMP1，CTNNB1，EDNRA，AKT1，CASP3，CASP9，BCL2，CASP8，NOS2，PIK3CG，AR，IL6，TP53，BIRC5，STAT3，MAPK1，HIF1A，JUN，BAX，VEGFA，MAPK8 乙肝181.30E-13PIK3CG，IL6，TNF，MMP9，TP53，NFKBIA，BIRC5，STAT3，TGFB1，AKT1，MAPK1，CASP3，CASP9，JUN，BAX，BCL2，CASP8，MAPK8 恰加斯?。乐掊F蟲?。?61.89E-13PIK3CG，IL6，TNF，CCL2，NFKBIA，TGFB1，AKT1，MAPK1，JUN，MAPK14，CASP8，IFNG，IL1B，MAPK8，NOS2，IL2 弓形蟲病164.44E-13TNF，NFKBIA，STAT3，TGFB1，AKT1，MAPK1，CASP3，CASP9，CD40LG，MAPK14，BCL2，CASP8，IFNG，MAPK8，ALOX5，NOS2 大腸癌131.59E-12PIK3CG，AKT1，MAPK1，CASP3，CASP9，JUN，BCL2，BAX，TP53，BIRC5，MAPK8，TGFB1，CTNNB1 蛋白聚糖在癌癥中182.59E-11PIK3CG，TNF，MMP9，TP53，ESR1，ITGB3，MMP2，STAT3，TGFB1，KDR，CTNNB1，AKT1，MAPK1，CASP3，HIF1A，MAPK14，VEGFA，PLAU 結(jié)核174.27E-11IL6，TNF，TGFB1，AKT1，MAPK1，CASP3，CASP9，BAX，MAPK14，BCL2，CASP8，IFNG，IL1B，CTSD，MAPK8，NOS2，IL1A HIF-1信號通路133.43E-10PIK3CG，AKT1，MAPK1，IL6，HIF1A，BCL2，HMOX1，VEGFA，IFNG，NOS3，NOS2，INSR，STAT3 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）155.84E-10PIK3CG，PPARA，IL6，TNF，TGFB1，AKT1，CASP3，CASP7，BAX，JUN，CASP8，IL1B，MAPK8，INSR，IL1A

圖5 活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生KEGG通路富集氣泡圖（前10位）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌梗死的基本病機(jī)為氣虛血瘀，據(jù)此設(shè)立的活血益氣法已被廣泛用于心肌梗死的治療，活血益氣方即依據(jù)活血益氣法組方而成。由于心肌梗死后血管新生是諸多因子參與的一系列相互銜接、相互影響的過程，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生靶點、成分、生物功能及通路進(jìn)行分析，能夠更好地闡釋其作用機(jī)制。

通過對活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生蛋白靶點相互作用關(guān)系分析可知，STAT3、JUN、AKT1蛋白與其他靶點蛋白的相互關(guān)聯(lián)程度最高，提示其可能參與的藥理作用最明顯。STAT3是STAT蛋白家族的一員，能被多種細(xì)胞因子和生長因子通過磷酸化反應(yīng)激活，介導(dǎo)多種基因的表達(dá)，在血管新生中起關(guān)鍵作用[15-16]。JUN蛋白指c-jun、junB及junD，是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族的成員。AP-1最主要的一個結(jié)構(gòu)形式是由c-jun和c-fos形成的異源二聚體，在環(huán)境損傷、氧化劑等環(huán)境因素的刺激下可激活c-jun和c-fos，進(jìn)而形成高活性的AP-1，AP-1與DNA結(jié)合后調(diào)控多種基因的表達(dá)，它通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞炎癥因子等促凋亡因子的表達(dá)，與血管生成密切相關(guān)[17]。AKT1是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，能夠調(diào)節(jié)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等多種生理過程[18-20]。

槲皮素、木犀草素等多個活血益氣方核心靶點所對應(yīng)的藥物成分具有心血管保護(hù)作用。槲皮素是黃酮類化合物，廣泛存在于水果和蔬菜中，可降低心血管疾病風(fēng)險。槲皮素及其代謝產(chǎn)物通過磷酸化AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性改善血管功能[21]。研究發(fā)現(xiàn)，切除小鼠右側(cè)股動脈誘導(dǎo)后肢缺血，給予槲皮素苷可顯著促進(jìn)缺血后肢血流量恢復(fù)，增加缺血肌肉毛細(xì)血管密度[22]。木犀草素具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性，在飲食中添加木犀草素可預(yù)防心血管疾病。木犀草素可減輕高碳水化合物/高脂肪飲食誘導(dǎo)的大鼠心肌炎癥[23]。山柰酚屬于黃酮類化合物，具有抗氧化活性和抗炎作用[24]，具有心血管保護(hù)作用[25-26]。黃芩苷具有預(yù)防和治療心血管疾病的潛力，能夠通過激活雌激素相關(guān)受體α途徑誘導(dǎo)VEGF表達(dá)而參與血管生成[27]。

對活血益氣方調(diào)控心肌梗死后血管新生的靶點蛋白GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，其功能富集覆蓋了心肌梗死后血管新生的許多過程，包括血管新生、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移參與發(fā)芽血管生成的正調(diào)控、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的陽性調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生的正調(diào)控、細(xì)胞對血管內(nèi)皮生長因子刺激的反應(yīng)，表明其通過多途徑、多靶點發(fā)揮治療作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，TNF信號通路及HIF-1信號通路可能是活血益氣方促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵通路。腫瘤壞死因子（TNF）作為一種重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活以及炎癥和免疫力。TNF信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)許多基因的激活，在血管新生中發(fā)揮著重要作用[28-29]。在心肌梗死后血管新生過程中，HIF-1信號通路在心肌梗死后心肌缺氧狀態(tài)下調(diào)控多種促血管新生因子如VEGF、血管生成素的協(xié)調(diào)表達(dá)，介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下的血管新生[30-31]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對活血益氣方促進(jìn)心肌梗死后血管新生的靶點及通路進(jìn)行分析，系統(tǒng)闡釋了活血益氣方可能的作用機(jī)制，可為該方機(jī)制的進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

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Mechanism ofDecoction in Promoting Angiogenesis After Myocardial Infarction Based on Network Pharmacology

WU Dandan, GUO Qianqian, GAO Yijie, WANG Manman, JIA Dongdong, YANG Rui, ZHANG Dongmei, ZHU Ke

To discuss the basis of active components ofDecoction in promoting angiogenesis after myocardial infarction based on network pharmacology; To predict its possible mechanism.Chinese materia medica indecoction including Astragali Radix, Codonipsis Radix, Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma, Chuanxiong Rhizoma, Paeoniae Radix Rubra and Carthami Flos were searched in TCMSP, active components were screened by OB ≥ 30% and DL ≥ 0.18, and corresponding targets with effective components were obtained. The targets of angiogenesis after myocardial infarction were retrieved from OMIM and GeneCards databases. The intersection between the target ofDecoction and the targets of angiogenesis after myocardial infarction was input into String database to obtain the PPI relationship and core targets according to the close degree of protein interaction. The core target-drug composition interaction network was visualized by using the software Cytoscape 3.7.0, and the network was analyzed by topology. The targets were analyzed by GO and KEGG pathway enrichment using DAVID database.Totally 148 active components ofDecoction and 275 targets were obtained. At the same time, 418 disease targets were obtained. There were 78 intersection targets. The PPI results showed that STAT3, JUN and AKT1 were closely related to other targets. GO biological function analysis and KEGG pathway enrichment of targets were found to involve 447 biological function items and 101 signaling pathways.Decoction regulates the treatment of angiogenesis after myocardial infarction through multi-component, multi-target, multi-pathway.

Decoction; network pharmacology; myocardial infarction; angiogenesis

R259.422.2；R285

A

1005-5304(2020)12-0076-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.201911494

國家自然科學(xué)基金面上項目（81273694、81973780）；北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費項目（2019-BUCMXJKT017）

張冬梅，E-mail：chaweto@126.com

（2019-11-26）

（2019-12-15；編輯：陳靜）