離體肝臟常溫機(jī)械灌注設(shè)備對(duì)紅細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

何錫然，黃小桃，譚曉宇，張琳，劉華敏，鄺偉鍵，梁銘炬，周偉津，郭家钘，陳素平，霍楓

1. 廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院），廣東 佛山 528311；2. 中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510010；3. 廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司，廣東 佛山 528311

引言

肝移植是治療終末期肝臟疾病的有效方法。然而由于供肝來(lái)源相對(duì)匱乏，嚴(yán)重限制了該項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用。數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年新增肝移植等待者約10000人，等待者常年超過(guò)15000人，但每年僅能完成6000例移植手術(shù)[1]。我國(guó)是肝病大國(guó)，終末期肝病患者達(dá)800萬(wàn)，每年約30萬(wàn)人死于終末期肝病，其中只有不到1%患者獲得肝移植機(jī)會(huì)[2]。為了解決供肝需求問(wèn)題，以往認(rèn)為風(fēng)險(xiǎn)較大的邊緣供體或者擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體逐漸用于臨床。邊緣供肝包括高齡、心死亡、器官功能?chē)?yán)重異常等供體來(lái)源的供肝，也包括長(zhǎng)時(shí)間冷保存和中重度脂肪變性等的供肝[3]。因?yàn)槿狈茖W(xué)有效的評(píng)估手段，邊緣供肝的質(zhì)量難以評(píng)價(jià)以至于棄用率較高[4]，使用后對(duì)移植受者預(yù)后影響較大[5]。雖然傳統(tǒng)靜態(tài)冷保存可以降低組織代謝和氧需求量延長(zhǎng)保存時(shí)間，但同時(shí)也導(dǎo)致細(xì)胞水腫和細(xì)胞損傷[6]。邊緣供肝長(zhǎng)時(shí)間的冷保存，移植失敗風(fēng)險(xiǎn)和受體死亡率顯著增加[7]。已有研究認(rèn)為常溫機(jī)械灌注技術(shù)（Normothermic Machine Perfusion，NMP）可以減少供肝冷保存損傷[7]，并評(píng)價(jià)供肝質(zhì)量[8-9]。此外，NMP通過(guò)灌注液為器官供氧和提供代謝底物的同時(shí)，可以添加保肝護(hù)肝藥物，有可能對(duì)供肝損傷起到修復(fù)作用[10]。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有市場(chǎng)化的肝臟NMP設(shè)備，國(guó)外也僅處于獲得歐盟認(rèn)證階段。本項(xiàng)目組構(gòu)建了離體肝臟NMP設(shè)備。目前常溫機(jī)械灌注最常用的氧載體為紅細(xì)胞[11]，本研究對(duì)設(shè)備在灌注過(guò)程中對(duì)紅細(xì)胞的影響進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)健康雌性巴馬小型豬6只，體重45～50 kg，由解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每頭實(shí)驗(yàn)豬作為血液和肝臟的供體。所有動(dòng)物均符合南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

常溫機(jī)械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，該設(shè)備由廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院）、解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)。該裝置可對(duì)離體肝臟進(jìn)行肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈雙重灌注。設(shè)備主要構(gòu)建部件有：2個(gè)離心泵（Revolution Centrifugal Pump，Sorin Group Italia S.r.l.）；2個(gè) 氧 合 器（EUROST EU5032 TRILLY Infant-Paediatric Oxygenator，EUROSETS S.r.l.）；溫度傳感器（精密型，佛山市亨遠(yuǎn)電子有限公司）；2個(gè)壓力傳感器（洛瑞，深圳市順美醫(yī)療股份有限公司）；2個(gè)流量傳感器（co.56/080，SONOTEC GmbH）；2個(gè)濾血栓（兒童，東莞科威醫(yī)療器械有限公司）；膽汁計(jì)數(shù)器；溫控水浴箱；自制的儲(chǔ)肝器、自制的灌注管路以及自制門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈、膽管連接管路等。各部件連接方式如圖1所示。

圖1 離體肝臟常溫機(jī)械灌注系統(tǒng)示意圖

1.1.3 儀器與試劑

呼吸機(jī)（S1100型，南京舒普思達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司）、多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀（M-9000S，深圳市艾瑞康醫(yī)療設(shè)備有限公司）、全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（IMS-70，常熟市圣海電器有限公司）、全自動(dòng)生化分析儀（Pointcare M3，天津微納芯科技有限公司）、雅培i-STAT300血?dú)夥治鰞x（美國(guó)雅培）、電子稱(chēng)（HY-809B，至尊）、一次性醫(yī)用靜脈留置針（24G，江西豐臨醫(yī)用器械有限公司）、導(dǎo)尿管（16Fr雙腔，湛江事達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）、硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司）、舒泰50（法國(guó)維克有限公司）、丙泊酚乳狀注射液（西安力邦制藥有限公司）、高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（上海輸血技術(shù)有限公司）、肝素鈉注射液（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司）、羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司）、注射用頭孢西丁鈉（國(guó)藥集團(tuán)致君（深圳）制藥有限公司）、注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（P fizer Manufacturing Belgium NV）。

1.2 豬血液及肝臟獲取

實(shí)驗(yàn)豬耳后肌內(nèi)注射硫酸阿托品注射液0.05 mg/kg，15 min后耳后肌肉注射舒泰50 2～3.5 mg/kg進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉。誘導(dǎo)麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針建立輸液通道，利用微量注射泵以每小時(shí)2～5 mg/kg的劑量泵入丙泊酚進(jìn)行維持麻醉。氣管插管，連接呼吸機(jī)，維持動(dòng)物正常呼吸。

腹部正中線(xiàn)大切口進(jìn)腹，游離腹主動(dòng)脈、下腔靜脈及門(mén)靜脈。經(jīng)耳緣靜脈注射25000 U肝素鈉，隨后于腹主動(dòng)脈和下腔靜脈置入自制16-Fr導(dǎo)管，利用內(nèi)含12500 U肝素鈉和8 mL生理鹽水的儲(chǔ)血袋收集血液。血液收集過(guò)程自動(dòng)過(guò)濾去除白細(xì)胞。

靜置實(shí)驗(yàn)豬60 min（即熱缺血60 min）后，結(jié)扎胸主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈插管，備4℃高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液1 L；同時(shí)進(jìn)行門(mén)靜脈插管，備4℃高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液1 L；剪開(kāi)肝靜脈出口，進(jìn)行在體冷灌注?？焖偃∠赂闻K，置入含4℃生理鹽水的容器。修整肝臟后，進(jìn)行肝動(dòng)脈和膽道插管。

1.3 常溫機(jī)械灌注液和常溫機(jī)械灌注參數(shù)設(shè)定

所有離體肝臟均采用常溫機(jī)械灌注，灌注時(shí)間為8 h。

NMP灌注液配制：灌注液總體積為1500 mL，包括豬全血，羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液，800 U肝素鈉注射液，1 g注射用頭孢西丁鈉，500 mg注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉。

啟動(dòng)灌注液循環(huán)即開(kāi)始利用氧合器供氧，給氧濃度為60%，氣體流量與血液流量之比為1：1，氧分壓在300～350 mmHg。肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈連接管分別按圖1所示連接循環(huán)管路。灌注溫度為37℃，肝動(dòng)脈灌注壓力設(shè)定為80/60 mmHg，門(mén)靜脈灌注流量按照肝臟重量設(shè)定為0.5 mL/[min·g（肝重）]。

1.4 觀察指標(biāo)

灌注過(guò)程，設(shè)備自動(dòng)記錄灌注液溫度、肝動(dòng)脈流量和門(mén)靜脈流量。灌注開(kāi)始時(shí)及之后每小時(shí)取適量灌注液，化驗(yàn)紅細(xì)胞壓積（Hematocrit，HCT）、血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）、總膽紅素（Total Bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（Indirect Bilirubin，IBIL）、溶血率、乳酸（Lactate，Lac）以及血糖（Glucose，Glu）等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（>±s）表示。樣本服從正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)灌注前后差異，若樣本不服從正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 物理參數(shù)

灌注過(guò)程中，灌注液溫度穩(wěn)定在37 ℃。肝動(dòng)脈初始流量最低值為（54.64±11.94） mL/min，隨著灌注過(guò)程延長(zhǎng)，最高達(dá)到（249.34±93.01） mL/min。門(mén)靜脈采用恒流模式控制，流量平均值穩(wěn)定在（442.67±79.19） mL/min。結(jié)果如圖2所示。

圖2 灌注溫度和流量

2.2 HCT與HGB水平

灌注開(kāi)始時(shí)HCT為（27.67±2.42）%，灌注8 h HCT為（28.00±2.45）%，兩者相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。灌注初期HGB為（9.40±0.81）g/dL，灌注8 h為（9.52±0.81）g/dL，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

2.3 膽紅素水平

灌注開(kāi)始時(shí)TBIL為（4.43±1.36）μmol/L，灌注8 h TBIL為（4.40±1.67）μmol/L，兩者水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IBIL在灌注開(kāi)始時(shí)為（1.43±1.04）μmol/L，灌注8 h為（1.73±0.47）μmol/L，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TBIL和IBIL在灌注過(guò)程中未見(jiàn)明顯升高，結(jié)果如圖4所示。

圖3 灌注液的HCT和HGB

圖4 灌注液的膽紅素水平

2.4 溶血率

灌注開(kāi)始和之后每小時(shí)化驗(yàn)灌注液樣本，均顯示無(wú)溶血，各時(shí)間點(diǎn)溶血率均為0，見(jiàn)表1。

表1 灌注過(guò)程中的溶血情況

2.5 Lac和Glu水平

灌注過(guò)程中，初期Lac水平為（2.52±0.39）mmol/L，灌注8 h Lac為（0.35±0.07） mmol/L，數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。葡萄糖灌注開(kāi)始時(shí)為（14.62±5.12） mmol/L，灌注1 h水平最高，為（21.37±5.96） mmol/L，灌注8 h為（9.78±2.63） mmol/L，灌注8 h與灌注開(kāi)始以及灌注1 h相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果如圖5所示。

圖5 灌注液的Lac和Glu水平

3 討論

常溫下離體肝臟NMP是近年來(lái)器官移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。該技術(shù)與低溫機(jī)械灌注或傳統(tǒng)冷保存不同，灌注液主要使用全血或紅細(xì)胞懸液。因此機(jī)械灌注過(guò)程中，磁懸浮驅(qū)動(dòng)灌注液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，是否會(huì)造成紅細(xì)胞溶血、破壞抑或消耗，是否可能導(dǎo)致紅細(xì)胞攜氧能力下降，是否會(huì)影響離體肝臟功能等問(wèn)題，對(duì)設(shè)備實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

臨床上反映紅細(xì)胞損耗的指標(biāo)常用HCT、HGB和溶血率。HCT是指血細(xì)胞在血液中所占容積的比值，反映紅細(xì)胞的增多或減少[12]。HGB是一種結(jié)合蛋白，是血液中紅細(xì)胞攜帶、運(yùn)輸氧氣和二氧化碳的載體。血液中98.5%的氧氣是與HGB結(jié)合成氧合HGB的形式存在和運(yùn)輸?shù)腫13]。溶血?jiǎng)t是指紅細(xì)胞破裂，HGB逸出。機(jī)械性強(qiáng)力振動(dòng)是溶血的常見(jiàn)原因之一。本研究利用自主構(gòu)建的常溫機(jī)械灌注設(shè)備進(jìn)行小型豬離體肝臟灌注實(shí)驗(yàn)，過(guò)程中對(duì)這三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)果顯示持續(xù)灌注8 h對(duì)HCT、HGB水平?jīng)]有影響，不會(huì)導(dǎo)致溶血。

為了進(jìn)一步了解紅細(xì)胞攜氧能力及灌注過(guò)程是否能改善離體肝臟功能，本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程動(dòng)態(tài)檢驗(yàn)灌注液TBIL、IBIL、Lac和Glu的水平，并監(jiān)測(cè)肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈流量。膽紅素是血液循環(huán)中衰老紅細(xì)胞在肝、脾及骨髓的單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中分解和破壞的產(chǎn)物，人體中由紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生的膽紅素占TBIL的80%～85%，當(dāng)紅細(xì)胞破壞過(guò)多時(shí)可引起膽紅素代謝障礙，當(dāng)TBIL增高伴IBIL明顯增高提示為溶血性黃疸[14]。本實(shí)驗(yàn)灌注過(guò)程中，TBIL和IBIL均比較平穩(wěn)，未見(jiàn)明顯波動(dòng)，進(jìn)一步證明了項(xiàng)目組構(gòu)建的設(shè)備不會(huì)導(dǎo)致溶血。血中Lac增多是組織嚴(yán)重缺氧時(shí)，糖分解代謝中的丙酮酸無(wú)氧酵解途徑生成Lac作用加強(qiáng)所致[15]。在氧供充足的情況下，葡萄糖進(jìn)行有氧氧化，生成二氧化碳和水，在缺氧情況，葡萄糖進(jìn)行無(wú)氧酵解，生成Lac[16]，提示Lac和葡萄糖水平可作為組織缺氧的指標(biāo)，間接證明紅細(xì)胞的攜氧能力。本研究灌注過(guò)程中，Lac和葡萄糖均被明顯消耗，間接提示了本研究灌注液中紅細(xì)胞具有較好的攜氧能力，能夠改善離體肝臟功能。

Banan等[17]利用豬為動(dòng)物模型，研究離體肝臟機(jī)械灌注系統(tǒng)對(duì)不同熱缺血損傷的肝臟的保存效果，他們將灌注液HCT控制在15%～20%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NMP能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)氨酶水平，同時(shí)可以增加膽汁生成和降低Lac水平，組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示NMP能夠改善壞死和缺血再灌注損傷。Bral等[18]利用動(dòng)物模型研究不同HGB水平灌注效果，發(fā)現(xiàn)HGB在20～30 g/L之間有助于降低Lac和Lac脫氫酶。Watson等[19]使用荷蘭的liver assist儀器進(jìn)行常溫機(jī)械灌注對(duì)廢棄人肝進(jìn)行研究，灌注液中的HGB水平和HCT分別設(shè)定為6.1 g/dL（范圍：5.1～7.4）和18%（范圍：16%～22%），結(jié)果顯示該常溫灌注條件能夠?qū)Ω闻K進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，并且肝臟能夠進(jìn)行肝移植手術(shù)。以上研究顯示，目前尚無(wú)統(tǒng)一的常溫機(jī)械灌注HCT標(biāo)準(zhǔn)。

Bral等[20]使用OrganOx公司的常溫機(jī)械灌注設(shè)備對(duì)人肝臟進(jìn)行離體灌注臨床研究，該常溫灌注的HGB水平為（104±18）g/L，HCT水平為（32±5）%，平均灌注時(shí)間為11.5 h，結(jié)果顯示所有肝臟在移植后均能發(fā)揮功能，證明了常溫灌注技術(shù)的安全性。Den Dries等[21]利用liver assist對(duì)四個(gè)廢棄人肝進(jìn)行了常溫灌注，在該研究中，灌注前、灌注 30 min和灌注6 h的HGB 水平分別為（4.7±0.1） mmol/L，（3.8±0.1）mmol/L，（3.9±0.2） mmol/L，而HCT水平則為（0.23±0.01）%（，0.19±0.01）%，（0.20±0.01）%，灌注結(jié)果顯示NMP能夠顯著降低Lac水平，改善肝細(xì)胞功能，同時(shí)也提示常溫灌注需要穩(wěn)定的HCT和HGB水平。本研究數(shù)據(jù)顯示我們構(gòu)建的設(shè)備能夠?qū)⒐嘧⒁篐CT、HGB、TBIL和IBIL維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，灌注液溶血率為0，而且可以改善灌注液Lac和Glu水平。此外，灌注過(guò)程中，肝動(dòng)脈流量逐漸增加，提示肝臟血管阻力下降、微循環(huán)改善，也間接反映了肝臟質(zhì)量改善。

4 結(jié)論

灌注過(guò)程，HCT、HGB、TBIL和IBIL均能維持穩(wěn)定，而且每小時(shí)的溶血率均為0，提示設(shè)備能夠在灌注過(guò)程中穩(wěn)定紅細(xì)胞的數(shù)量。持續(xù)的Lac和葡萄糖消耗，間接提示紅細(xì)胞的攜氧能力有助于改善肝功能。但是評(píng)價(jià)紅細(xì)胞的功能需要檢測(cè)更多指標(biāo)，如紅細(xì)胞變形能力、游離HGB水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板、外周血細(xì)胞活化特異性釋放產(chǎn)物等。同時(shí)今后將會(huì)開(kāi)展更長(zhǎng)時(shí)間的灌注時(shí)間，包括12 h和24 h，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)設(shè)備在長(zhǎng)時(shí)間灌注時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的影響。另外，將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討不同HCT水平的灌注液對(duì)離體肝臟的影響。