巖黃連中生物堿的研究進(jìn)展

張 成，姚興東，雷福厚

（廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530001）

巖黃連是罌粟科紫堇屬多年生草本植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting)的全草，又名巖連、土黃連，主要分布于廣西、湖北、甘肅、四川、貴州、云南等地[1]，是廣西本地應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)壯藥。廣西民間用其根消腫止痛、拔毒，治療疥瘡腫毒、肝炎、肝硬化及肝癌等[2]。研究顯示，巖黃連中的主要有效成分是生物堿類化合物，具有抗炎抗菌、鎮(zhèn)痛、保肝、安定、抗肝炎病毒、抗腫瘤等作用[3]。目前對(duì)巖黃連的系統(tǒng)研究尚不多見，主要原因是巖黃連的資源較稀缺，不易獲取。本文對(duì)巖黃連的化學(xué)成分和生物堿的提取與分離，以及藥理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)單的歸納總結(jié)，以期為巖黃連的深入研究與開發(fā)提供更多參考。

1 植株形態(tài)與分布

巖黃連屬罌粟目罌粟科，為多年生草本植物，全株無毛。植株高15～40cm，主根發(fā)達(dá)。莖1～3條，叢生，軟弱，葉具長(zhǎng)柄，葉片輪廓三角狀卵，二回羽狀全裂，總狀花序頂生或與葉對(duì)生，長(zhǎng)7～14cm，苞片橢圓形至披針形，蒴果圓柱狀，略彎曲，種子多數(shù)圓形，種阜杯狀，包住種子一半。巖黃連主要分布于廣西、貴州、云南、湖北、四川等省，在廣西多見于桂西及桂西北等地，在東蘭、巴馬、鳳山等縣分布較多[4]。

2 有效化學(xué)成分

迄今為止，從巖黃連中分離出來且得到研究的化學(xué)成分以生物堿類為主。巖黃連中的生物堿主要為四氫原小檗堿型、小檗堿型、阿樸菲型、血根堿型芐基異喹啉類生物堿[5]?？络腌隱6]用pH梯度分離法，在強(qiáng)堿性部位分離得到小檗堿[berberine]及脫氫卡維丁[dehydrocavidine]；弱堿性部位經(jīng)硅膠低壓柱層析及制備性薄層層析，得到卡維丁[(±)cavidine]、β-羥基刺罌粟堿 [(-)13β-hydroxystilopine]、延 胡 索 甲 素 [(+)tetrahydropalmatine]、(-)四 氫 非洲防己胺[(-)tetrahydrocolumbamine]、白屈菜紅堿[chelerythrine]、(-)斯庫來堿 [(-)scoulerine]、原阿片堿[protopine]等7種不同的生物堿。此后又在巖黃連中發(fā)現(xiàn)了白蓬葉堿[(+)thalictrifoline][7]。周元瑤[8]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)巖黃連中含有沙明堿(corysamine)、黃連堿(coptisine)、非洲防己堿(columbamine)、去氫碎葉紫堇堿(dehydrocheilanthifoline)。王奇志等[9-10]報(bào)道了巖黃連中含有刺檗堿(oxyacanthine)、別隱品堿(allocryptopine)、巴馬汀(palmatine)等生物堿以及胡蘿卜苷(daucosterol)、白樺脂醇(betulin)、白樺脂酸(betulinic acid)、齊墩果酸 (oleanolicacid)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、環(huán) 桉 烯 醇 (cycloeucalenol)、β-香 樹脂醇乙酸酯(β-amyrin acetate) 等10種新化合物。Huang等[11]用甲醇進(jìn)行提取，采用硅膠色譜法和高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，從巖黃連中分離出(+)硝基金剛烷胺、小檗堿、巴馬汀、脫氫卡維丁和血根堿等12種異喹啉生物堿，其中包括2個(gè)新的含硝基四氫小檗堿。何志超等[12]用70%乙醇，從巖黃連全草提取得到16個(gè)化合物，其中氫化小檗堿、碎葉紫堇堿、去氫碎葉紫堇堿、去氫分離木瓣樹胺、深山黃堇堿等5種化合物為新分離的化合物。吳揚(yáng)[13]采用高效制備液相色譜技術(shù)，對(duì)巖黃連總堿進(jìn)行分離純化，首次從巖黃連中分離得到藥根堿。毛宇昂[14]通過制備液相和柱層析，獲得了3種新化合物：十四-氨基-二十七烷、十四-氨基-二十八烷、膽甾醇。

從已報(bào)道的文獻(xiàn)看，目前公認(rèn)的巖黃連的有效成分是生物堿，其中含量較高的3種生物堿小檗堿、巴馬汀、脫氫卡維丁被認(rèn)為是主要的活性組分，研究最多，其結(jié)構(gòu)式見圖1。值得注意的是，脫氫卡維丁[15]是巖黃連所特有的季銨堿類化合物，具有明顯的保護(hù)肝組織及抗肝纖維化的作用，以及抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用，其藥理作用和分離分析方法研究是巖黃連研究中的熱點(diǎn)。

圖1 巖黃連中3種主要生物堿的結(jié)構(gòu)

3 巖黃連的主要藥理作用

3.1 抗菌

巖黃連中的主要有效成分是以脫氫卡維丁為代表的生物堿類化合物。脫氫卡維丁類生物堿對(duì)革蘭氏陽性菌、白喉?xiàng)U菌、乙型溶血性鏈球菌等有明顯抑制作用[16]。丘倩倩[17]在體外培養(yǎng)革蘭氏陽性菌和陰性菌，用巖黃連總堿進(jìn)行抑菌、殺菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，巖黃連總堿對(duì)常見的9種革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制和殺菌效果。葉琦莉[18]通過革蘭氏陽性菌和陰性菌的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了巖黃連中的脫氫卡維丁對(duì)革蘭氏陽性菌有一定的抑制作用。

3.2 消炎

肖萍[19]采用機(jī)械損傷法，用大腸埃希菌、白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌的混合菌建立起慢性盆腔炎模型大鼠，給予3個(gè)不同劑量的巖黃連栓治療20d，采用Elisa檢測(cè)大鼠血清中的超氧岐化酶、腫瘤壞死因子、白介素的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巖黃連栓對(duì)慢性盆腔炎大鼠有一定的治療和免疫調(diào)節(jié)作用。

李麗[20]使用二甲苯和醋酸，分別進(jìn)行了小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)、毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)和小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)，探討巖黃連的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)巖黃連對(duì)小鼠腫脹、毛細(xì)血管通透性增加及小棉球肉芽腫的形成有明顯的抑制作用，表明巖黃連對(duì)多種炎癥有明顯的抑制作用。

黃燮南等[21]將50mg·kg-1巖黃連總堿對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)能減輕旦清性“關(guān)節(jié)炎”大鼠的足腫脹程度。諸葛明麗等[22]采用小鼠耳腫脹法、小鼠皮內(nèi)色素滲出法和小鼠扭體法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巖黃連直腸栓對(duì)巴豆油致小鼠耳腫脹、乙酸致毛細(xì)血管通透性的增加及乙酸腹腔注射致小鼠扭體反應(yīng)，均有明顯的抑制作用。

3.3 抗腫瘤

趙一等[23]發(fā)現(xiàn)，巖黃連總生物堿對(duì)小白鼠肉瘤(S180)、小白鼠艾氏腹水癌(EAC)、小白鼠肝癌腹水癌(HAC)及大白鼠癌肉瘤(W256)有較顯著的抑制作用。李金花[24]發(fā)現(xiàn)，巖黃連總堿具有一定的抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且抑制作用與時(shí)間和劑量表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。顧福莉[25]將巖黃連注射液應(yīng)用到直腸癌的治療中，結(jié)果顯示，巖黃連注射液能夠提高直腸癌的化療效果，提高機(jī)體細(xì)胞的免疫功能，改善患者的生活質(zhì)量。鞠佳霓[26]將不同濃度的巖黃連水提物作用于肝癌HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巖黃連水提物濃度為1.6mg·mL-1時(shí)，48h可表現(xiàn)出對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞最強(qiáng)的抑制作用。

3.4 抗肝炎病毒

傳統(tǒng)上，巖黃連主要被壯族群眾應(yīng)用于保肝護(hù)肝和治療各類肝病?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連的有效成分巖黃連總堿包括脫氫卡維丁、右旋四氫巴馬汀、小檗堿等，可消除肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，對(duì)肝膽管有消炎作用，可促進(jìn)膽汁排泄及肝細(xì)胞再生，修復(fù)受損肝細(xì)胞[27]。巖黃連對(duì)甲、乙、丙肝炎病毒均有不同程度的抑制和殺滅作用，并能較快地產(chǎn)生抗體，且能有效穩(wěn)定肝細(xì)胞膜和線粒體膜，起到保肝護(hù)肝的作用[28]。

王健[29]將不同濃度的巖黃連提取物作用于感染DHBV的廣西麻鴨，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）法，檢測(cè)出使用高濃度巖黃連提取物的麻鴨血清中，DHBV-DNA的含量有降低，表明巖黃連提取物對(duì)DHBV導(dǎo)致的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

3.5 保肝

吳方[30]將健康大鼠分為4組，把模型組、巖黃連總組、聯(lián)苯雙酯組進(jìn)行皮下注射CCl4橄欖油溶液，建立慢性肝損傷模型，空白組大鼠皮下注射等體積的橄欖油溶液，每周1次，連續(xù)注射8周，最后1周采集大鼠尿樣。分析結(jié)果顯示，巖黃連總堿能干預(yù)性治療慢性肝損傷的大鼠。

劉旭文[31]通過代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)巖黃連的化學(xué)成分中的樺木酸、P-香樹脂醇乙酸酯和深山黃堇堿可能通過調(diào)節(jié)FXR、COX-2和MMP-1靶點(diǎn)，起到抗肝纖維化的作用。黃興振[32]通過巖黃連提取物對(duì)四氯化碳和對(duì)乙酰氨基酚所致的急性肝損傷的保護(hù)作用，對(duì)大鼠膽汁流量、免疫功能的影響進(jìn)行了研究，同時(shí)進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，大劑量的巖黃連提取物能明顯減輕肝組織的受損程度，對(duì)由對(duì)乙酰氨基酚所致的急性肝損傷也有一定的保護(hù)作用。

4 巖黃連中生物堿的提取和分離方法

生物堿是廣泛存在于自然界的一類含氮有機(jī)化合物，一般具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多呈堿性，可以和酸形成鹽，大多數(shù)有特殊而顯著的活性。

巖黃連所含的生物堿多為季銨類生物堿，易溶于水和醇，因此常見的提取方法是將酸水、醇類與超聲、回流等方法聯(lián)合使用[33]。多數(shù)文獻(xiàn)以脫氫卡維丁與總生物堿的含量為指標(biāo)，來確定巖黃連生物堿提取效率的高低。

王靜[34]以巖黃連中的脫氫卡維丁和總生物堿的含量為指標(biāo)，將乙醇與酸水、回流與滲漉兩種不同的溶劑與提取方法作比較，通過L9(34)正交設(shè)計(jì)，確定了使用乙醇、回流法提取巖黃連中的生物堿的工藝條件，并優(yōu)化了醇提工藝，最優(yōu)提取條件為：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取時(shí)間2h。在最優(yōu)條件下測(cè)得脫氫卡維丁的提取率為0.99%、總生物堿的提取率為3.56%。

李林[35]采用超聲提取巖黃連中的生物堿。將巖黃連藥材粉碎，過0.833mm篩。精密稱取粉末0.1g置于具塞錐形瓶中，精密加入1% HCl的甲醇溶液25 mL，超聲處理40 min，測(cè)得廣西產(chǎn)的巖黃連生物堿中脫氫卡維丁的含量為1.35%、總生物堿的含量為4.90%。

李倩霞[36]在用酶處理后再用乙醇回流，提取巖黃連藥材中的生物堿，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶處理工藝的參數(shù)。酶解反應(yīng)的最佳工藝條件為：溫度45℃、酶反應(yīng)時(shí)間16 h、pH=5.0、酶用量0.9 %。實(shí)驗(yàn)測(cè)得巖黃連總生物堿的提取率為4.83%。

綜上所述，巖黃連中的生物堿用1% HCl的甲醇溶液進(jìn)行回流，超聲提取，所得的生物堿含量較高，且操作簡(jiǎn)單，提取效率高。

由于中草藥中有多種生物堿同時(shí)存在，一般需根據(jù)各種生物堿的酸堿性、溶解性及特殊官能團(tuán)的差異，對(duì)其進(jìn)行分離純化[37-38]。巖黃連中大多數(shù)生物堿的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較為相近，因此難以通過簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行分離。已報(bào)道的分離純化方法主要是柱色譜法和高速逆流分配色譜法。

李倩霞等人[39]以總生物堿和脫氫卡維丁含量為指標(biāo)，研究了6種不同的樹脂對(duì)巖黃連總生物堿的吸附能力。結(jié)果顯示，D101型大孔吸附樹脂對(duì)巖黃連總生物堿的比吸附量和比洗脫量較高。將巖黃連粗提液與使用D101型樹脂純化后的色譜圖進(jìn)行比較，其色譜峰的數(shù)目及相對(duì)峰面積組成基本一致，表明樹脂純化工藝對(duì)巖黃連提取液中的化學(xué)成分的影響不顯著。

毛宇昂采用硅膠柱層析和快速硅膠柱層析方法分離巖黃連浸膏，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氨水為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，使用薄層檢測(cè)分析各餾分。合并表現(xiàn)相同的餾分，經(jīng)濃縮干燥，得到21個(gè)不同的餾分，分別為小檗堿、黃連堿、膽甾醇和原小檗堿類化合物，部分餾分需要進(jìn)一步檢測(cè)。

毛春芹等人[40]采用高效液相色譜，從巖黃連中分離出脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿，其色譜條件為：Agilent XDB C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol·mL-1磷酸二氫鉀水溶液(21∶79)，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)347nm，體積流量 1.0 mL·min-1。

吳揚(yáng)等人用高效液相制備色譜技術(shù)對(duì)巖黃連總堿進(jìn)行分離純化，色譜柱為COSMOSIL5C18-MS-Ⅱ(250mm×10mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇和水（20∶80），流速 2.0 mL·min-1。通過結(jié)構(gòu)鑒定，得到6種生物堿，分別為鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫碎葉紫堇堿、脫氫甲卡維丁、脫氫卡維丁和藥根堿。

蔣偉哲等人[41]用醇-酸水-氯仿體系從巖黃連中提取總生物堿，然后采用制備色譜系統(tǒng)AKTA Explorer 100分離巖黃連堿。色譜條件為：色譜柱600mm×16mm，以安瑪西亞的SOURCE30RPC為柱填充料，流動(dòng)相為0.2 mol·L-1的Na2HPO4(pH=8.5)-乙腈，梯度洗脫（前40 min乙腈比例由10%升至40%，40 min后為 50%），流速 3mL·min-1，進(jìn)樣量2mL。

梁鎮(zhèn)然[42]利用柱層析分離，將巖黃連醇提物經(jīng)溶劑萃取后的水相提取物，對(duì)其中一個(gè)餾分采用高速逆流色譜法，以正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水（體積比 0.4∶1.5∶4∶0.4∶5∶0.11）為兩相溶劑系統(tǒng)，得到純度為97.0%的去氫碎葉紫堇堿和純度為90.7%的脫氫異阿樸卡維汀。

程軒軒等人[43]采用高速逆流色譜技術(shù)，以正丁醇-乙酸乙酯-水-甲酸(5∶1∶5∶0.01)和正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶1∶9∶0.05)作為兩相溶劑系統(tǒng)，分離巖黃連中的主要生物堿，最終從巖黃連的粗提物中得到6個(gè)純度較高的生物堿。劉朝亮[44]采用高速逆流色譜法，對(duì)巖黃連中的脂溶性生物堿進(jìn)行制備分離，溶劑系統(tǒng)為正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶5∶5；1.5∶5∶1.5∶5)、正己烷-醋酸乙酯-甲醇-0.2 mol·L-1鹽酸(1∶3.5∶2.5∶4.5)。上相作固定相，下相作流動(dòng)相，經(jīng)連續(xù)高速逆流色譜分離,直接從巖黃連的粗提物中得到4個(gè)純度較高的脂溶性生物堿。

從文獻(xiàn)的結(jié)果看，采用柱色譜法能夠?qū)追N生物堿進(jìn)行較好的分離。其中高速逆流色譜法的分離效率高，處理量大，分離成本低，有望在今后得到更多應(yīng)用。

5 巖黃連中生物堿分析方法的研究進(jìn)展

巖黃連中所含的生物堿主要為小檗堿、巴馬汀和脫氫卡維丁，3種生物堿均為強(qiáng)堿性季銨類生物堿，不揮發(fā)，極性大，且結(jié)構(gòu)與性質(zhì)非常相似，難以分離。從已報(bào)道的分析方法看，有效成分分析一般均采用高效液相色譜法，采用的色譜柱主要是ODS非極性柱，如Agilent XDB C18、SHISEIDO-SPOLAR C18[45]、Lichrosopher-C18、Kromasil C18[46]等。 由 于這幾種生物堿均具有較強(qiáng)的極性，因此采用非極性柱進(jìn)行分離的效果并不理想。筆者曾采用Agilent XDB-C18和 ThermoODS-2hypersil色譜柱，以文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相體系進(jìn)行液相色譜分離實(shí)驗(yàn)，均難以將3種生物堿分開。提高固定相極性，增加生物堿在色譜柱上的保留，有望改善分離效果。近幾年本課題組研究和開發(fā)了幾種弱極性色譜固定相，如核殼型SiO2@松香基高分子（Ru131）液相色譜固定相[47]、核殼型SiO2@松香基高分子（Ru532）液相色譜固定相[48]、松香基手性高分子印跡聚合物等，作為液相色譜固定相[49]和漆酚酯鍵合硅膠液相色譜固定相[50]，對(duì)生物堿類極性化合物具有較好的分離效果，表現(xiàn)出較高的應(yīng)用潛力，具有較好的應(yīng)用前景。