牛的胚胎移植技術(shù)

吳長玉，王廷斌，孫明林

（1.富錦市種畜場，黑龍江 富錦 156100；2.佳木斯市家畜繁育指導(dǎo)站，黑龍江 佳木斯 154007）

對于家畜的遺傳改良，胚胎移植能從基因?qū)用娓玫恼故灸感蟮膬?yōu)良血統(tǒng)。胚胎移植技術(shù)距今已有110 多年的研究發(fā)展歷史。雖然人工授精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于家畜的遺傳改良，但是胚胎移植也已證明是一種極為強(qiáng)大的技術(shù)手段，特別是用于優(yōu)良血統(tǒng)母畜的基因擴(kuò)繁。對于奶牛業(yè)，推廣優(yōu)良母牛采用超數(shù)排卵和胚胎移植（MOET），能促進(jìn)良種繁育。

1 激素處理

對牛進(jìn)行單個胚胎的收集，通常在對超排供體母牛進(jìn)行激素處理后，再進(jìn)行大量的胚胎移植。在牛，有兩種超數(shù)排卵（超排）技術(shù)：一種是在發(fā)情期第10 天肌內(nèi)注射PMSG 2 000～2 500 U，之后2～3 d 每隔12～24 h 注射2 次前列腺素PGF2α。發(fā)情牛需做直腸檢查，以確認(rèn)卵泡，若在發(fā)情后1.5 d以后排卵的不能用作受體牛。

使用PMSG的超排效果強(qiáng)于FSH，但使用FSH得到的胚胎質(zhì)量卻更高，所以商業(yè)上常使用FSH進(jìn)行超排。商業(yè)應(yīng)用的FSH 來自豬腦垂體提取物，混有LH。然而如果混有過多LH干擾FSH的最佳超排效果，但是少量的LH反而更有利于FSH的超排效果。

據(jù)報道稱，一次性注射FSH可以獲得滿意的結(jié)果，但應(yīng)連續(xù)肌內(nèi)注射FSH 4～5 d，每日2次為最佳。商業(yè)用FSH用生理鹽水稀釋到20 mL，然后連續(xù)使用4～5 d。使用FSH 注射4 d 的方法是：第1 天4 mL·次-1，2 次·d-1；第2 天3 mL·次-1，2次·d-1；第3天2 mL·次-1，2次·d-1；第4天1 mL·次-1，2 次·d-1，總量為20 mL。出現(xiàn)發(fā)情后第10 天應(yīng)用FSH。應(yīng)用FSH后第3天或第4天注射PGF2α，12 h后重復(fù)1次。36～48 h后出現(xiàn)發(fā)情，發(fā)情開始后12及24 h觀察體溫變化，以進(jìn)行人工授精，或在72、84、96 h 應(yīng)用HCG 或GnRH 促進(jìn)排卵。對奶?？捎玫某欧椒ê芏唷１热绯徘白⑸浯贫蓟蛘哧幍莱槿?yōu)勢卵泡。這些方法的目的是獲得更多可用胚胎。

2 受體處理

觀察到供體自然發(fā)情后，應(yīng)同步對受體進(jìn)行處理。供體牛和受體牛的比例一般為1：6～8。受體要選擇體格大，膘情好，繁殖機(jī)能正常的適繁健康母牛。在移植前6～8周，對受體母牛逐頭注射VA、VB、VD、VE 針劑，補(bǔ)充微量元素。在供體首次注射PGF2α12 h之前受體應(yīng)注射PGF2α，受體會與供體同期排卵，但通過比較，供體與受體注射PGF2α相差±1 d比較好。超排率可以達(dá)到75%～90%，但20%～30%超排的母牛所產(chǎn)胚胎質(zhì)量不好。使用FSH可以獲得高質(zhì)量的胚胎（每次能沖洗出0～20 個胚胎）。每次收集胚胎平均能獲得5～7個高質(zhì)量的胚胎，即可認(rèn)為是滿意的商業(yè)結(jié)果。

3 胚胎采集和處理

可在發(fā)情周期第7 天即胚胎定植子宮時進(jìn)行胚胎采集。在采集胚胎之前，超排之后供體母牛觸診子宮可摸到黃體。從子宮液中采集胚胎方法如下：5～7 mL利多卡因硬膜外腔麻醉；使用肥皂或消毒劑洗凈外陰，用量依據(jù)動物及其子宮頸大小，將安裝有金屬桿的導(dǎo)尿管插入陰道，用伸入直腸的觸診手臂將導(dǎo)尿管導(dǎo)入子宮頸；插入子宮頸后，將導(dǎo)尿管深入到一側(cè)子宮角上1/3處；取出導(dǎo)尿管里的金屬桿，管口充滿15～20 mL 空氣，空氣量與子宮角大小有關(guān)，也與品種、年齡、胎次等有關(guān)；子宮頸中含有沖洗液，該液體富含抗生素及牛血清白蛋白，有些還有表面活性劑以減少胚胎形成泡沫；用沖洗液沖洗子宮角，每次25～50 mL，少量重復(fù)多次，將沖洗液導(dǎo)入胚胎濾器，可持續(xù)沖洗子宮角，或使用1～2 L沖洗液連續(xù)沖洗子宮；沖洗完成后，沖洗液會流入胚胎濾器中；胚胎濾器送到實(shí)驗室后，應(yīng)將其內(nèi)容物放入檢查盤中，可在10倍解剖顯微鏡下觀察。將所有觀察到的胚胎移入到另一個干凈培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中有含有10%～20%胎牛血清或0.4%牛血清白蛋白的緩沖液。然后在40～60倍的高倍鏡下觀察胚胎，依據(jù)胚胎形態(tài)、發(fā)育程度（未受精卵母細(xì)胞、早期桑葚胚、緊密桑葚胚、胚泡、擴(kuò)張胚泡、孵出胚泡等）、質(zhì)量（優(yōu)秀、良好、一般、差劣、變質(zhì)）進(jìn)行分類。質(zhì)量判定依據(jù)胚胎的完整性、胚胎發(fā)育情況、細(xì)胞質(zhì)顏色、細(xì)胞退化、卵裂球數(shù)量、卵周隙距離和胚胎大小等形態(tài)特征進(jìn)行評估。

只有中等、良好或優(yōu)秀的胚胎可以移植；至少清洗胚胎3遍之后將其保存在培養(yǎng)液中。將移植的胚胎移入干凈的含有培養(yǎng)液的器皿中，目的是剔除細(xì)胞碎片及可能黏附在透朋帶上的病原體。在室溫下保存胚胎，直到移植入受體中或冷凍或進(jìn)行性別判斷。

4 胚胎植入

胚胎移植時可用0.25 mL細(xì)管分3段吸入PBS保存液，中間由2個氣泡隔開，中斷含有胚胎。胚胎移植槍放在無菌的套子里，以避免移植槍頭部對動物會陰部和陰道造成污染。借助于直腸檢查，將移植槍送入子宮頸，然后再插入同側(cè)帶有黃體的子宮角。細(xì)管里的胚胎等內(nèi)容物要盡量置于細(xì)管頂端，以避免延長不必要的手術(shù)時間。第1次接受胚胎移植后，60%～70%的受體可以妊娠，移入2 個胚胎的受孕率可高達(dá)90%。大量的牛移植胚胎都是經(jīng)過良好處理的凍融胚胎（46%），一般的受孕率＞50%。在同樣的條件和熟練的操作技術(shù)下，凍融胚胎理論上比新鮮移植的胚胎受孕率低10%。孕酮具有保胎作用，注射孕酮，可提高受胎率。早期確診的方法有放射免疫測定和酶聯(lián)免疫測定。雖然移入的胚胎量越多動物的妊娠率越高，但是由雙胎引起的難產(chǎn)和胎衣不下的危險率也會增高，而且由此而導(dǎo)致的異性孿生不孕的可能性增高，從而限制了這種方法的廣泛應(yīng)用。