血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的診斷效能

劉巖，任思思，馬秋晟，徐麗娜

天津市北辰醫(yī)院，天津300400

膿毒癥是感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，炎癥反應(yīng)失控可造成多器官功能障礙綜合征，影響患者的臨床預(yù)后。相關(guān)研究[1，2]報(bào)道顯示，全球目前大約有1800萬例膿毒癥患者，且發(fā)病率呈不斷上升趨勢。膿毒癥有較高的發(fā)病率和死亡率，是引起急性腎損傷(AKI)的最常見病因。研究[3～5]顯示，在膿毒癥患者中，AKI的發(fā)生率為40%～50%，且膿毒癥患者發(fā)生AKI后住院死亡率可增加6～8倍，遠(yuǎn)期慢性腎臟病和心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。目前膿毒癥并發(fā)AKI尚缺乏有效的治療手段，因此，尋找早期診斷膿毒癥并發(fā)AKI的血清學(xué)指標(biāo)，有助于臨床早期干預(yù)并改善預(yù)后。目前臨床常用于評估膿毒癥并發(fā)AKI的血清標(biāo)志物主要包括血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、尿腎損傷分子-1和血半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，但診斷的準(zhǔn)確性不高，臨床應(yīng)用價(jià)值受限[6]。miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)腎臟功能的調(diào)節(jié)過程。既往研究[7]報(bào)道，miR-10a過表達(dá)對于膿毒癥并發(fā)AKI具有腎臟保護(hù)作用。研究[8]發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-35(IL-35)可能參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng),可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)過程，與膿毒癥患者的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究觀察了血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發(fā)AKI的診斷效能，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月～2019年1月天津市北辰醫(yī)院收治的膿毒癥患者100例，根據(jù)是否并發(fā)AKI，分為AKI組和非AKI組。AKI組患者43例，男26例、女17例，年齡(53.72±12.53)歲；非AKI組患者57例，男30例、女27例，年齡(51.86±11.91)歲，兩組患者性別、年齡等資料具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①膿毒癥的診斷根據(jù)2012年國際嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克診療指南[9]標(biāo)準(zhǔn)；②AKI的診斷依據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)臨床實(shí)踐指南[10]標(biāo)準(zhǔn)：與基線血肌酐比較，48 h內(nèi)血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內(nèi)血肌酐升高≥基線值的1.5倍定義為AKI；③膿毒癥并發(fā)AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足膿毒癥和AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)；④患者自愿參與并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者入院時(shí)已進(jìn)入慢性腎臟病五期或長期行腎臟替代治療；②由膿毒癥以外其他病因?qū)е碌腁KI，包括腎小球腎炎、腎血管性疾病、腎小球壞死、泌尿系統(tǒng)梗阻、應(yīng)用腎毒性藥物等；③截肢術(shù)后患者；④腎移植術(shù)后患者。依據(jù)AKI分級標(biāo)準(zhǔn)將AKI組43例膿毒癥并發(fā)AKI患者分為Ⅰ級組(23例)、Ⅱ級組(14例)、Ⅲ級組(6例)。Ⅰ級：48 h內(nèi)血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內(nèi)血肌酐升高為基線值的1.5～1.9倍；Ⅱ級：7 d內(nèi)血肌酐升高為基線值的2.0～2.9倍；Ⅲ級7 d內(nèi)血肌酐升高≥基線值的3.0倍或血肌酐≥353.6 μmol/L或開始腎臟替代治療。

1.2 各組患者血清miR-10a檢測 采用PT-PCR法。清晨空腹?fàn)顟B(tài)時(shí)采集患者肘部靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，將獲取的血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用RNA提取純化試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。miR-10a上游引物為5′-GGAGGGGTACCA-GAATCCCATTTTGGCCA-3′，下游引物為5′GGAGGAAGCTTGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以2-ΔΔCt表示血清中miR-10a的相對表達(dá)量。

1.3 各組患者血清IL-35檢測 采用ELISA法。取離心后的血清，采用ELISA法檢測血清IL-35水平，檢測流程依據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平比較 AKI組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平分別為3.34±0.53、(501.74±36.79)pg/mL，非AKI組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平分別為1.09±0.32、(269.47±28.79)pg/mL，兩組相比，P均<0.001。Ⅰ級組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平分別為2.98±1.06、(438.84±26.89)pg/mL，Ⅱ級組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平分別為4.31±1.82、(521.94±32.69)pg/mL，Ⅲ級組患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平分別為5.89±1.98、(598.54±26.79)pg/mL，組間相比，P均<0.001。

2.2 血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的診斷效能 血清miR-10a水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的曲線下面積為0.765(95%CI為0.698～0.813)，取截?cái)嘀禐?.23時(shí)，血清miR-10a水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的敏感度為79.34%、特異度為81.23%；血清IL-35水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的曲線下面積為0.801(95%CI為0.765～0.892)，取截?cái)嘀禐?98.74 pg/mL時(shí)，血清IL-35水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的敏感度為78.65%、特異度為82.46%；血清miR-10a聯(lián)合IL-35水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的曲線下面積為0.875，取血清miR-10a水平的截?cái)嘀禐?.23、血清IL-35水平的截?cái)嘀禐?98.74 pg/mL時(shí)，診斷膿毒癥并發(fā)AKI的敏感度為83.56%、特異度為88.21%。

3 討論

膿毒癥是危重癥患者常見的臨床綜合征，病死率高，臨床預(yù)后較差。研究[11]顯示，膿毒癥危重癥患者病死率約為45.2%，而膿毒癥并發(fā)AKI后病死率可增加至74.5%。研究[12]表明，膿毒癥并發(fā)AKI的患者臨床并發(fā)癥遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于單純膿毒癥未并發(fā)AKI的患者以及非膿毒癥AKI患者。膿毒癥患者由于炎癥誘發(fā)細(xì)胞缺氧和氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起腎臟血流動(dòng)力學(xué)變化，腎臟血流灌注不足，細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷和凋亡，最終導(dǎo)致腎臟損傷并誘發(fā)AKI的發(fā)生[13]。目前膿毒癥并發(fā)AKI早期診斷困難，尋找早期診斷膿毒癥并發(fā)AKI的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。在腎臟調(diào)控和介導(dǎo)損傷的過程中，腎臟可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致調(diào)節(jié)關(guān)鍵通路的信號蛋白的高表達(dá)或低表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，介導(dǎo)腎臟損傷[14]。近年來，不少研究[7]證實(shí)，miRNA在評估膿毒癥并發(fā)AKI的臨床預(yù)后方面具有重要作用。既往研究[15]表明，miR-10a是調(diào)控免疫應(yīng)答水平的關(guān)鍵因子之一，在炎癥性腸病、風(fēng)濕免疫性疾病、腫瘤等領(lǐng)域得到深入廣泛的研究，而在膿毒癥并發(fā)AKI患者中尚未得到深入的認(rèn)識。炎癥是引起膿毒癥的病因，而白細(xì)胞介素作為趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥損傷和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要的作用。有研究[16]表明，在膿毒癥并發(fā)AKI的患者中，IL-35通過抑制Teff和Th17等的免疫活性，在免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，抑制相應(yīng)的免疫應(yīng)答。此外，L-35還可以通過上調(diào)IL-10分泌及調(diào)節(jié)型T細(xì)胞比例，抑制IL-2與IFN-γ生成，抑制過度激活的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)[17]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-10a和IL-35在膿毒癥并發(fā)AKI的患者中表達(dá)上升，且AKI分級越高，miR-10a和IL-35的表達(dá)水平越高，由此提示，miR-10a和IL-35表達(dá)上調(diào)可能介導(dǎo)膿毒癥患者的腎臟損傷，且miR-10a和IL-35的水平與膿毒癥并發(fā)AKI的嚴(yán)重程度相關(guān)。由于miR-10a和IL-35參與膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，而當(dāng)炎癥誘發(fā)腎臟損傷時(shí)，可通過基因調(diào)控以及介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子的表達(dá)，參與炎癥損傷過程，進(jìn)而導(dǎo)致miR-10a和IL-35的表達(dá)升高[18]。IL-35作為一種新發(fā)現(xiàn)的、具有強(qiáng)力免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子，與多種疾病包括感染性疾病、膿毒癥、自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等密切相關(guān)[8]，膿毒癥患者由于較強(qiáng)的免疫炎癥反應(yīng)，需要上調(diào)IL-35水平以抑制相應(yīng)的免疫應(yīng)答。而miR-10a上調(diào)能夠提高TNF-γ及IL-2等炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和介導(dǎo)腎臟損傷。因此，miR-10a和L-35可能可以作為膿毒癥并發(fā)AKI治療和干預(yù)的新靶點(diǎn)。

此外，本研究通過ROC分析還發(fā)現(xiàn)，血清miR-10a聯(lián)合IL-35水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的曲線下面積高于miR-10a和IL-35單獨(dú)診斷膿毒癥并發(fā)AKI的曲線下面積，特異性高達(dá)88.21%，敏感性高達(dá)83.56%。由此可見，血清miR-10a和IL-35水平在膿毒癥并發(fā)AKI的診斷方面具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。由于膿毒癥并發(fā)AKI本身是炎癥介導(dǎo)的腎臟損傷過程，而miR-10a和IL-35參與炎癥損傷過程，因此，血清miR-10a聯(lián)合IL-35對于早期診斷膿毒癥并發(fā)AKI以及評估疾病的嚴(yán)重程度具有重要的作用。

綜上所述，膿毒血癥并發(fā)AKI患者血清miR-10a相對表達(dá)量、IL-35水平升高，與AKI分級有關(guān)；檢測血清miR-10a、IL-35有助于膿毒癥并發(fā)AKI的診斷和疾病嚴(yán)重程度的評估。miR-10a和IL-35可以作為膿毒癥并發(fā)AKI早期診斷和評估嚴(yán)重程度的血清標(biāo)志物，有可能成為膿毒癥并發(fā)AKI治療的新靶點(diǎn)。