Spred蛋白及其相關(guān)miRNA研究進(jìn)展

龔堅(jiān) 劉巧

1江西中醫(yī)藥大學(xué)（南昌330004）；2江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（南昌330012）

Spred 家族是一組Sprouty 相關(guān)的酪氨酸激酶結(jié)合蛋白，目前哺乳動(dòng)物中有Spred-1、Spred-2、Spred-3 和Eve-3 四個(gè)家族成員，廣泛存在各種生物組織中；其家族成員主要由N 末端的EVH1（Enabled/VASP homology-1），中部的KBD（Thec-Kit bindingdomain）和C 末端的SPR（Sprouty-relateddomain）三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，不同結(jié)構(gòu)域影響不同的生物學(xué)功能［1-3］。Sped 蛋白對(duì)多種生長因子誘導(dǎo)的Ras-ERK 信號(hào)途徑有負(fù)調(diào)控作用，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管增生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程。microRNA（miRNA）是一種非編碼性單鏈小分子RNA，廣泛存在于生物細(xì)胞中，可與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)（3′-UTR）結(jié)合形成沉默復(fù)合體，然后導(dǎo)致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因的翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)；與細(xì)胞增殖、分化、器官形成以及免疫應(yīng)答過程等都息息相關(guān)［4］。研究表明，Spred 是多種miRNA 的靶蛋白，它們能通過調(diào)節(jié)Spred 蛋白表達(dá)，參與多種疾病進(jìn)程中。本文就近年Spred 蛋白及其相關(guān)miRNA 研究進(jìn)展作一綜述。

1 Spred 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)及生物學(xué)功能

1.1 Spred蛋白與Ras/MAPK信號(hào)通路Ras/MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著極為重要的作用。WAKIOKA 等［1］通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首次證明Spred 蛋白家族對(duì)于Ras/MAPK 信號(hào)通路抑制作用，但是其具體結(jié)合靶分子尚不明確；隨著近年對(duì)Spred 蛋白研究的增多，越來越多的證據(jù)表明Spred蛋白家族是Ras/MAPK 信號(hào)通路抑制劑；在細(xì)胞表面整合素、FGF 受體、細(xì)胞因子受體等酪氨酸激酶受體受到刺激后，胞內(nèi)蛋白質(zhì)如SHC、GRB2 和SHP2 被激活并募集細(xì)胞質(zhì)中SOS，后者促使GDPRas 轉(zhuǎn)化為GTP-Ras，即RAS 蛋白被磷酸化激活；GTP-Ras 募集Raf-1 激酶并使Raf-1 磷酸化，后者進(jìn)而激活Erk 等在內(nèi)的下游蛋白［5］；在這一過程中Spred 能特異性地增強(qiáng)激活的Ras 和Raf 之間的相互作用，形成復(fù)合體，抑制Raf 活化，繼而抑制下游通路的激活［1］。

1.2 Spred 蛋白生物學(xué)功能Erk1/2 激酶活化是T 細(xì)胞中幾種生長因子的信號(hào)級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵事件，它也是在T 細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致T 細(xì)胞的活化和增殖的下游事件；腫瘤微環(huán)境中高水平的TGF-β可導(dǎo)致上游TCR 信號(hào)傳導(dǎo)組分的下調(diào)，同時(shí)伴隨著Spred-1 的上調(diào)，這些結(jié)果導(dǎo)致Erk途徑的抑制，從而導(dǎo)致腫瘤浸潤性CD8+T 細(xì)胞的增殖/細(xì)胞因子產(chǎn)生受損，可見Spred 蛋白與腫瘤細(xì)胞免疫抑制密切相關(guān)［6］。在對(duì)Spred-2 KO 小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，該類小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)缺陷、抑郁以及類似強(qiáng)迫癥行為，如皮膚敏感、強(qiáng)迫性自我修飾等，進(jìn)一步研究表明Spred-2 缺乏導(dǎo)致小鼠杏仁核中原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）、Ras 和Erk 活性的增加介導(dǎo)了通路的過度激活誘發(fā)，并且該途徑失調(diào)會(huì)導(dǎo)致突觸前、后mRNA 和蛋白質(zhì)的變化以及丘腦-杏仁核傳遞的改變；這一結(jié)果表明，Spred-2 可能是不同大腦區(qū)域突出傳遞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［7］。心臟功能取決于平衡的蛋白質(zhì)更新，因此，調(diào)節(jié)蛋白衰減對(duì)于維持心臟功能至關(guān)重要。研究表明，Spred-2-/-小鼠表現(xiàn)出心肌細(xì)胞肥大，心臟纖維化，電興奮性受損和嚴(yán)重的心律失常。其機(jī)制可能是Spred-2 缺失，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)介質(zhì)失調(diào)及Erk 過度活化，繼而引起心肌細(xì)胞功能異常，最終導(dǎo)致心臟功能障礙；由此可見Spred-2 參與心肌細(xì)胞自噬功能及調(diào)節(jié)心臟功能的過程［8］。除上述生物學(xué)功能外，近年研究表明Spred 蛋白還參與了腫瘤細(xì)胞增殖、分化，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，血管增生及修復(fù)，細(xì)胞自噬，肺臟發(fā)育，骨生長，淋巴管生成等多種生理病理過程。

2 Spred-1 蛋白與miRNA

研究表明，在小鼠胚胎中，Spred-1 蛋白在心、肝、肺、腦組織有強(qiáng)表達(dá)，說明Spred-1 對(duì)胚胎發(fā)育有重要作用；而在成熟小鼠中Spred-1 蛋白主要在大腦中表達(dá)最強(qiáng)，小鼠肺、心臟、肝、腎、腸、脾、睪丸、胸腺和卵巢等組織中也能觀察到Spred-1 的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Spred-1 與這些臟器的多種疾病密切相關(guān)［9］。miRNA 作為非編碼RNA，在對(duì)研究發(fā)病機(jī)制愈發(fā)重要，而其具體機(jī)制尚不完全清楚。目前發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 調(diào)控因子通過調(diào)控Spred-1 蛋白，繼而參與的疾病的發(fā)生發(fā)展。

2.1 miR-126miR-126 是由表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）基因的內(nèi)含子7 編碼的miRNA，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中表達(dá)，包含miR-126-3p和miR-126-5p 兩條成熟鏈［10-11］。EC 表達(dá)的miR-126 可以激活VEGF 依賴的信號(hào)通路并促進(jìn)血管生成及調(diào)節(jié)血管完整性，在這一過程中Spred-1 作為miR-126-3p 靶蛋白發(fā)揮重要作用［12-13］；因此，miR-126 通過調(diào)節(jié)Spred-1 蛋白參與和血管增生、修復(fù)等相關(guān)疾病，如心腦血管疾病、腫瘤、肺部疾病、糖尿病血管病變、眼部血管相關(guān)疾病等。

在心肌梗死老鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死老鼠心肌組織中miR-126 表達(dá)明顯降低，但通過丹參紅注射液干預(yù)治療后miR-126 表達(dá)升高，同時(shí)抑制了Spred-1 表達(dá)，并激活了ERK 途徑，促進(jìn)了血管生成作用，達(dá)到修復(fù)心肌的作用［14］。缺血性卒中是全世界死亡和殘疾的主要原因之一，血管生成被認(rèn)為是缺血性中風(fēng)后修復(fù)和重塑的有希望的療法［15］。miRNA 分析研究揭示miR-126 在年輕卒中患者中下調(diào)［16］；而在短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）的研究中發(fā)現(xiàn)，在TIA 發(fā)病3 h 內(nèi)miR-126 開始下降，到12 h 顯著低于健康人，而Spred 則相反，二者呈現(xiàn)明顯時(shí)間相關(guān)性；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TIA發(fā)作后隨時(shí)間延長外周血（VEGF）濃度逐漸升高，這些結(jié)果提示在TIA 中miR-126 調(diào)控Spred-1 表達(dá)參與VEGF 信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及血管修復(fù)中［17］。病理性視網(wǎng)膜新生血管（RNV）是眼科疾病視力喪失的主要原因之一，而研究表明miR-126 和Spred-1可能作為治療RNV 相關(guān)眼病的新型分子靶標(biāo)，其機(jī)制是在RNV 的發(fā)展過程miR-126 可通過抑制Spred-1 表達(dá)來促進(jìn)誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（IPS 細(xì)胞）中VEGF 的表達(dá)，進(jìn)而有助于血管生成［18］。有研究表明，miR-126、Spred-1 參與白血病、肝癌、胃癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生；如在經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞（TACE）后肝細(xì)胞癌（HCC）模型中，通過抑制miR-126 的表達(dá)水平促進(jìn)Spred-1 的表達(dá)，可抑制VEGF 通路調(diào)節(jié)TACE 后HCC 患者血管生成［19］；可見miR-126、Spred-1 在腫瘤發(fā)生及治療中均重要作用。

2.2 miR-212 及miR-132/212miR-212 和miR-132 基因以相同的結(jié)果存在于生物組織，與神經(jīng)功能、腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠紋狀體中的miR-212 在接觸可卡因10 d 后開始增加，并持續(xù)存在；其機(jī)制可能是miR-212 介導(dǎo)的Spred-1 表達(dá)抑制進(jìn)而促進(jìn)Raf-1 激活擴(kuò)增CREB 信號(hào)，從而調(diào)節(jié)可卡因攝入的效應(yīng)［21-22］。在miRNA-132/212 KO 的股動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)灌注恢復(fù)現(xiàn)象，說明miR-132/212 參與該模型動(dòng)脈生成過程，而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，miR-132/212簇是通過直接靶向其抑制劑Rasa1 和Spred-1 調(diào)節(jié)Ras-MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)來促進(jìn)動(dòng)脈發(fā)生［23］。以上研究表明，Spred-1 是miR-212 及miR-132/212 參與藥物成癮及動(dòng)脈發(fā)生的重要調(diào)控因子。

2.3 miR-196amiR-196a 是由HOX 家族基因轉(zhuǎn)錄而來，不僅參與調(diào)節(jié)脂肪分布、干細(xì)胞細(xì)胞分化等生物學(xué)過程，而且還在食管癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因的功能［24］；國內(nèi)學(xué)者在對(duì)乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Spred-1 是miR-196 的直接靶標(biāo)，它通過抑制c-Raf 信號(hào)通路在miR-196a 促進(jìn)BC 細(xì)胞增殖，遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌激素受體（ER）可調(diào)控的miR-196a，進(jìn)而調(diào)節(jié)Spred-1 蛋白表達(dá)，最后影響腫瘤生長和血管生成；結(jié)果表明，miR-196a 及其靶標(biāo)Spred-1 在雌激素介導(dǎo)的乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，這可能有助于為乳腺癌提供新的治療靶點(diǎn)［25］。

2.4 其他除上述miRNA 外，miR-1、miR-21、miR-144、miR-182、miR-206、miR-409 均能靶向Spred-1 蛋白表達(dá)，參與疾病發(fā)生。研究表明，miR-1 是心肌梗死早期敏感標(biāo)志物；當(dāng)心肌梗死發(fā)生后，miR-1 表達(dá)升高促使人類來源的心肌細(xì)胞祖細(xì)胞（hCMPCs）被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞，從而在體外形成血管網(wǎng)絡(luò)，幫助完成心肌梗塞后心肌修復(fù)；在這過程中過表達(dá)的miR-1 抑制Spred-1 表達(dá)，從而減輕Spred-1 對(duì)由促血管生成生長因子激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制作用，進(jìn)而完成血管重建工作；可見miR-1 在心肌梗死早期及后期修復(fù)中均有重要作用［26-27］。miR-144、miR-182、miR-206/21 在調(diào)節(jié)各種癌癥中的細(xì)胞增殖，克隆形成，遷移，侵襲和腫瘤形成中起重要作用；SHARMA等［28］研究發(fā)現(xiàn)Spred-1 是miR-144新的靶標(biāo)，在69%食道癌（EC）組織中下調(diào)，而且65%的食管癌組織中觀察到Spred-1 mRNA 水平與miR-144表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而在惡性口腔癌組織中，通過持續(xù)上調(diào)miR-182抑制Spred-1表達(dá)，促使Ras/Raf/Erk信號(hào)傳導(dǎo)激活并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［29-30］。在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，miR-206/21 協(xié)作通過抑制RASA1和Spred-1 的翻譯來促進(jìn)RAS-Erk 信號(hào)傳導(dǎo)和相應(yīng)的細(xì)胞表型表達(dá)［31］。鄭劍等［32］通過對(duì)三氯乙烯藥疹樣皮炎（OMLDT）患者血清研究發(fā)現(xiàn)，miR-409 在OMLDT 患者中具有差異表達(dá)，其可能靶向調(diào)節(jié)Spred-1 的表達(dá)，通過下調(diào)MAPK 信號(hào)通路，造成三氯乙烯藥疹樣皮炎患者的肝損傷。

3 Spred-2 蛋白與miRNA

Spred-2 蛋白在人體各種組織及成熟大鼠的各種組織中廣泛表達(dá)，包括消化道、肺、腎和肝［33］；在疾病研究中，組織廣泛表達(dá)的Spred-2 蛋白正作為多種miRNA 的調(diào)控靶標(biāo)備受重視。

3.1 miRNA-487amiR-487a 定位于14 號(hào)染色體，在調(diào)節(jié)癌癥遷移中起作用；有報(bào)道其參與乳腺癌［34］、前列腺癌［35］等腫瘤發(fā)生。而在肝細(xì)胞癌中，CHANG 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，Spred-2 是miR-487a 的直接靶標(biāo)，并且miR-487a 可通過與Spred-2 mRNA 的30-UTR 的2527-2549 位點(diǎn)和2575-2597 位點(diǎn)結(jié)合來抑制Spred-2 表達(dá)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-487a通過調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞中miR-487a 介導(dǎo)的MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；說明miR-487a 和Spred-2可成為肝細(xì)胞癌的潛在治療靶點(diǎn)。

3.2 miR-210miR-210 是一種由HIF-1α調(diào)節(jié)的缺氧反應(yīng)性microRNA，廣泛參與血管生成、腫瘤發(fā)生等生理病理過程［37-38］；Spred-2 是其50 余個(gè)靶基因中之一，被認(rèn)為是miR-210 參與頸動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和胃腸道腫瘤調(diào)控靶基因。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）是導(dǎo)致心血管疾病（CVD）和消化道腫瘤的常見致病因素，研究發(fā)現(xiàn)，oxLDL 誘導(dǎo)的miR-210 可以增 強(qiáng)Spred-2/ERK/c-Fos/MMP 信號(hào)傳導(dǎo)，繼而參與腫瘤細(xì)胞增殖和遷移；而使用異種移植小鼠模型和喂食高脂肪飲食的ApoE KO 小鼠的動(dòng)物研究進(jìn)一步支持了oxLDL、miR-210、Spred-2與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)的關(guān)系［39］。

3.3 其他Spred-2 是miR-1246、miR-221 和miR-485-3p 靶基因之一，但在不同疾病中表達(dá)。在一項(xiàng)結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)研究中抗癌基因Spred-2 被鑒定為miR-1246 的下游靶標(biāo)，而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，類甲基轉(zhuǎn)移酶3（METTL3）可以甲基化pri-miR-1246，促進(jìn)pri-miR-1246 的成熟，進(jìn)而通過MAPK 通路促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活動(dòng)，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤提供了新的治療靶點(diǎn)［40］。在小兒哮喘和其他不同的哮喘表型中，多種miRNA 表達(dá)失調(diào)，其中miRNA-221 和miRNA-485-3p 表達(dá)上調(diào)，Spred-2 蛋白水平表達(dá)下調(diào)［41］；而研究表明，在小兒哮喘及哮喘小鼠模型中，Spred-2 是miRNA-221 和miRNA-485-3p 的預(yù)測靶標(biāo)，上調(diào)miRNA-221 和miRNA-485-3p抑制Spred-2 mRNA 表達(dá)，繼而參與過敏原誘導(dǎo)的氣道炎癥和高反應(yīng)性［42］。由此可見，多miRNA 調(diào)控的Spred-2 在疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。

4 Spred-1/2 蛋白與miRNA

Spred-1、Spred-2 可共同表達(dá)于多種動(dòng)物組織及人體組織中，如肺、腦等組織中，部分miRNA 能通過調(diào)控這兩種蛋白參與疾病進(jìn)程中。有研究表明，Spred-1、Spred-2 均是miR-31 靶蛋白；在對(duì)在人和小鼠肺癌的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，miR-31 表達(dá)增加，而miR-31 的4 種靶蛋白Spred-1、Spred-2、RASA1 和SPRY4 減少，且前后者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能是miR-31 升高抑制Spred-1、Spred-2 表達(dá)，繼而導(dǎo)致Erk 活化增加，導(dǎo)致肺腫瘤細(xì)胞增殖增加；這種情況在肺腺癌中更突出［43-44］。同樣，在表皮修復(fù)過程中，miR-31 通過靶向Spred-1、Spred-2等Ras/MAPK 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子從而激活Ras/MAPK 信號(hào)通路，繼而通過該通路完成傷口周圍細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，加快損傷組織的修復(fù)［45］；由此可見miR-31 通過靶向Spred-1、Spred-2 參與部分疾病。

5 結(jié)語與展望

綜上所述，部分miRNA 通過調(diào)控Spred 蛋白表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，血管增生修復(fù)，氣道炎癥及高反應(yīng)性，損傷組織修復(fù)等等病理生理過程，進(jìn)而參與多種疾病發(fā)生發(fā)展。隨著探索的深入，相信會(huì)有更多的miRNAs 被證明在疾病中調(diào)節(jié)Spred 蛋白的表達(dá)，這對(duì)于完善miRNA 參與疾病發(fā)生的機(jī)制大有裨益。目前，在多基因、多miRNA、網(wǎng)絡(luò)式立體的研究疾病的現(xiàn)在，Spred 蛋白及其相關(guān)miRNA 的基礎(chǔ)研究取得了一定成果，特別是在腫瘤及心腦血管疾病方面，然而少有基礎(chǔ)研究上的臨床研究及應(yīng)用研究；因此，如何探索、建立Spred 蛋白及其相關(guān)miRNA 對(duì)疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究以及在優(yōu)勢病種方面的臨床研究及成果轉(zhuǎn)化應(yīng)是下一步研究方向。