富血小板血漿改善卵巢功能及體外受精結(jié)局的作用機(jī)制

唐曼紅，王玉霞 ，嚴(yán)玥，洪成浩

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州)

0 引言

富血小板血漿(PRP)是含有超過(guò)生理濃度5-10倍血小板的血漿，主要通過(guò)釋放細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子發(fā)揮修復(fù)作用。這一作用的理論支持基于組織損傷的自然修復(fù)過(guò)程，機(jī)體發(fā)生損傷后將第一時(shí)間招募血小板，募集后的血小板釋放各種活性物質(zhì)吸引干細(xì)胞完成組織的自我修復(fù)[1]。PRP療法作為一種新型的臨床治療模式已被廣泛應(yīng)用于以整形美容科、骨關(guān)節(jié)科、皮膚科為主的各大科室。

隨著人類對(duì)病因?qū)W的深入探究，PRP在維持女性生殖能力中的作用得到諸多關(guān)注。通過(guò)促進(jìn)原始卵泡發(fā)育、修復(fù)子宮內(nèi)膜等機(jī)理，PRP在治療以卵巢、子宮因素為主的不孕癥中的作用得以顯現(xiàn)。目前，輔助生殖技術(shù)(ART)對(duì)于常規(guī)治療無(wú)效的不孕癥患者具有相對(duì)普適性，PRP的出現(xiàn)既能從根本上提高不孕癥患者的生殖潛能，又能為ART的開(kāi)展提供有力的環(huán)境支持，從而提高妊娠率及活產(chǎn)率，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。本文就PRP對(duì)于改善卵巢功能及IVF結(jié)局的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 PRP的生物學(xué)特征與臨床應(yīng)用

1.1 制備與分類

抽取自體或供體全血通過(guò)數(shù)次離心得到由紅細(xì)胞和血小板組成的軟顆粒，將其均質(zhì)化后形成PRP。每30mL的靜脈血大約可提取3-5mL的PRP制劑，并可根據(jù)制備方法、樣品含量及應(yīng)用范圍等對(duì)其進(jìn)行分類。多學(xué)科共識(shí)委員會(huì)基于細(xì)胞因子含量與纖維蛋白密度將PRP制劑分為四種類型：純富血小板血漿(P-PRP)、富白細(xì)胞和血小板血漿(L-PRP)、純富血小板纖維蛋白(P-PRF)、富白細(xì)胞和血小板的纖維蛋白(LPRF)[2]。

1.2 組成與活化

高濃度的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子是PRP制劑主要的生物學(xué)特征，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等，這些活性物質(zhì)可在PRP經(jīng)凝血酶、氯化鈣、膠原蛋白等激活后于局部損傷部位大量釋放或進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，及時(shí)參與受損組織的修復(fù)過(guò)程[3]。血小板促進(jìn)傷口愈合的另一重要機(jī)制是其自身存在支持再生基質(zhì)的纖維蛋白框架，能迅速建立適當(dāng)?shù)慕M織形態(tài)和分子構(gòu)型。

1.3 臨床應(yīng)用

近十年來(lái)，PRP因其普遍適用及高效性已在臨床上被廣泛應(yīng)用于相關(guān)疾病的防治。一方面，頭皮下注射自體PRP制劑在促進(jìn)頭皮組織生長(zhǎng)的同時(shí)也改善毛囊環(huán)境，增加毛發(fā)密度，因而被應(yīng)用于雄激素性脫發(fā)[4]。另一方面，PRP可刺激成纖維細(xì)胞的活化并促進(jìn)膠原蛋白及透明質(zhì)酸的合成，為皮膚再生學(xué)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)[5]。此外，因其具有緩解角膜充血、降低眼滲透壓的作用，PRP常用來(lái)改善分泌性干眼癥患者的視力[6]。同時(shí)，對(duì)于退行性骨關(guān)節(jié)炎患者，PRP除了能促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成，還可抑制炎癥的發(fā)生[7]?；赑RP在組織損傷愈合的過(guò)程中發(fā)揮的作用，近幾年來(lái)，學(xué)者們對(duì)其在女性生殖系統(tǒng)疾病的作用進(jìn)行了探索與研究，發(fā)現(xiàn)PRP不僅能改善女性的卵巢功能，還能提高不孕癥患者接受體外受精周期的成功率。

2 PRP改善卵巢功能的分子機(jī)制

2.1 TGF-β聯(lián)合多種細(xì)胞因子預(yù)防卵巢衰竭

卵巢衰竭主要表現(xiàn)為甾體激素缺乏、排卵障礙、閉鎖卵泡數(shù)量增加，PRP主要通過(guò)刺激卵泡發(fā)育、促進(jìn)排卵、減少卵泡閉鎖及抑制卵巢組織凋亡來(lái)預(yù)防卵巢衰竭。

PRP富含的血小板α顆粒激活后釋放的TGF-β，包括骨形成發(fā)生蛋白15(BMP-15)及生長(zhǎng)分化因子9(GDF-9)，在早期已被證實(shí)為卵母細(xì)胞的特異生長(zhǎng)因子[8]。BMP-15及GDF-9對(duì)卵母細(xì)胞的作用主要通過(guò)影響卵巢顆粒細(xì)胞(GC)的發(fā)育實(shí)現(xiàn)，二者通過(guò)激活GC的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體調(diào)控SMAD蛋白，通過(guò)與SMAD的相互作用將信號(hào)傳導(dǎo)給細(xì)胞核，再與特定的轉(zhuǎn)錄因子作用，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，經(jīng)雙向信號(hào)調(diào)控(卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞調(diào)控環(huán))最終促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育、增殖及分化[9]。并且BMP-15、GDF-9之間存在協(xié)同作用，BMP-15/GDF-9異二聚體(累積蛋白)可直接與GCs相應(yīng)受體結(jié)合，激活SMAD2/3、SMAD1/5/8信號(hào)通路，導(dǎo)致下游基因的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)與卵母細(xì)胞調(diào)節(jié)的GCs分化相關(guān)基因的增殖與表達(dá)，以此改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量。其次，二者可通過(guò)細(xì)胞間的縫隙連接利用膽固醇合成途徑的產(chǎn)物來(lái)滋養(yǎng)卵母細(xì)胞。再次，BMP-15還可抑制類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)減少黃體酮的產(chǎn)生，從而抑制卵泡黃素化。另外，BMP-15、GDF-9可激活卵丘細(xì)胞中有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)，恢復(fù)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。GDF-9還可刺激透明質(zhì)酸合成酶-2、前列腺素合成酶-2的表達(dá)，促進(jìn)卵丘擴(kuò)張并發(fā)生排卵[10,11]。

除 TGF-β外，PRP釋放的 PDGF、VEGF、EGF、CTGF、IGF-1也參與了改善卵巢功能的過(guò)程。PDGF、IGF-1通過(guò)酪氨酸激酶受體通路介導(dǎo)，觸發(fā)DNA合成和細(xì)胞周期特異性原癌基因fos和myc，使卵母細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)入有絲分裂[12]。c-myc可促進(jìn)卵巢組織凋亡，在閉鎖卵泡中大量表達(dá)，Samira Seyyed Anvari 在研究PRP與PCOS的相關(guān)作用時(shí)檢測(cè)到經(jīng)PRP治療后的PCOS小鼠c-myc表達(dá)顯著降低，閉鎖卵泡的數(shù)量也明顯減少[13]。VEGF則負(fù)責(zé)卵泡膜細(xì)胞及GC之間的血管網(wǎng)絡(luò)，為卵泡發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]。卵母細(xì)胞需要依賴EGF網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的卵丘細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)成熟過(guò)程中的mRNA翻譯，F(xiàn)SH調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞翻譯也是通過(guò)EGFR介導(dǎo)[15]，而且EGF樣肽參與調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞內(nèi)糖酵解和卵母細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過(guò)程，由此促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[16]。CTGF與TGF-β、WNT和MAPK通路相互作用，是細(xì)胞黏附、遷移、增殖及分化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子[17]。綜上，PRP主要通過(guò)刺激卵泡發(fā)育、促進(jìn)排卵、減少卵泡閉鎖及抑制卵巢組織凋亡來(lái)預(yù)防卵巢衰竭。

2.2 VEGF、PDGF調(diào)控卵巢血供及氧化應(yīng)激反應(yīng)

PRP通過(guò)增加卵巢組織的血液灌注、抑制卵巢組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)減少卵巢組織在缺血-再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞壞死及凋亡，這一過(guò)程主要由PRP釋放的活性因子VEGF及PDGF發(fā)揮作用。

首先，PRP可增加卵巢缺血組織的血液灌注。卵巢扭轉(zhuǎn)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致動(dòng)靜脈管腔阻塞、壞死，持續(xù)的缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致卵巢發(fā)生不可逆的組織損傷。VEGF、PDGF及TGF-β1在早期已被證實(shí)可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化和血管生成。其中，VEGF是一種血管生成肽，能減輕多種器官的缺血-再灌注損傷，它不僅可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和遷移，還可通過(guò)釋放PDGF-BB促進(jìn)血管壁細(xì)胞的積累，并且能將造血干細(xì)胞從骨髓募集到缺血部位，這些干細(xì)胞分化成毛細(xì)血管叢，最終形成成熟的血管，從而增加卵巢缺血組織的血液灌注。Shyamal Chandra Bir在研究PRP的血管生成特性時(shí)發(fā)現(xiàn)PRP處理組小鼠離體后肢的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、血管密度及血液灌注狀態(tài)均明顯優(yōu)于對(duì)照組[18]。Murat Bakacak 在研究PRP對(duì)大鼠卵巢缺血再灌注損傷的保護(hù)作用時(shí)也觀察到PRP處理組的腹膜VEGF濃度明顯高于對(duì)照組，并且PRP處理組的卵巢出血、間質(zhì)水腫的情況也得到顯著改善[19]。因此，PRP可通過(guò)增加卵巢組織的血管生成與血液灌注來(lái)減輕其缺血-再灌注損傷。

其次，PRP可抑制卵巢組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在缺血-再灌注過(guò)程中，組織產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)、促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子，這些物質(zhì)的大量生成會(huì)超過(guò)卵巢組織自身的抗氧化能力，引起細(xì)胞和線粒體膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及壞死[20]。缺血時(shí)中性粒細(xì)胞聚集導(dǎo)致ROS增多從而進(jìn)一步加重組織損傷，由PRP釋放的VEGF可抑制缺血-再灌注組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少ROS的產(chǎn)生，并刺激抗凋亡因子mRNA的表達(dá)，促進(jìn)生殖細(xì)胞的存活[21]。同時(shí)，PDGF還可通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2—抗氧化反應(yīng)原件信號(hào)來(lái)防止氧化損傷[22]。另外，PRP還可作為細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)信使，通過(guò)抑制ASK-1和pNF-κB的表達(dá)降低活性氧和促炎細(xì)胞因子的水平。實(shí)驗(yàn)觀察到，經(jīng)PRP處理后的大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激指數(shù)(OSI)及平均總氧化狀態(tài)(TOS)均明顯低于對(duì)照組[13,19]。由此可見(jiàn)，PRP可通過(guò)抑制卵巢組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)減輕其缺血-再灌注損傷。

3 PRP提高體外受精成功率的潛在機(jī)制

3.1 通過(guò)改善子宮內(nèi)膜容受性降低RIF率

RIF是指接受IVF周期的不孕癥婦女至少連續(xù)三次優(yōu)質(zhì)胚胎植入失敗[23]。胚胎植入與著床與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)，子宮內(nèi)膜容受性低下是導(dǎo)致RIF的主要原因之一。PRP可通過(guò)改善子宮內(nèi)膜條件及抑制子宮內(nèi)膜炎癥來(lái)提高子宮內(nèi)膜容受性，從而降低RIF率。

首先，PRP分泌的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子通過(guò)細(xì)胞旁分泌作用，刺激子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移、增殖、分化，從而誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜組織再生，增加子宮內(nèi)膜厚度。經(jīng)宮腔灌注PRP治療后，難治性薄型子宮內(nèi)膜患者的內(nèi)膜厚度普遍可達(dá)7mm以上[24-26]。其次，PRP增加與子宮內(nèi)膜血管增殖相關(guān)的SUSD、CD105、CD146的表達(dá)，改善血管分布[27]，這不僅為胚胎著床創(chuàng)造了優(yōu)良的土壤條件，同時(shí)為胚胎發(fā)育提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。另外，PRP還可激活Hippo信號(hào)通路，下調(diào)CTGF并上調(diào)WNT5a與GDF-5的表達(dá)。CTGF是TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞作用的下游介質(zhì)，其表達(dá)減少有助于抑制子宮內(nèi)膜纖維化，形成正常的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。WNT5a的表達(dá)子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育有關(guān)，在體外可促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞，而GDF-5參與子宮內(nèi)膜蛻膜化，對(duì)胚胎著床至關(guān)重要[28]。有體外證據(jù)表明，短期PRP刺激可激活A(yù)kt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子3(STST-3)途徑的磷酸化，上調(diào)FOXo1、LIF、IL1-β的表達(dá)，這些活性物質(zhì)均為子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物[27]，尤其LIF介導(dǎo)了滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附，可增加子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床[29]。

胚胎植入是炎癥和抗炎平衡的結(jié)果，這些機(jī)制的不平衡將會(huì)導(dǎo)致RIF。在胚胎植入過(guò)程中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞對(duì)植入前胚胎產(chǎn)生的HCG產(chǎn)生反應(yīng)，合成IFNG、IL-1B、IL-6、IL-8、PDGF、TNF、VEGF等活性因子，這些因子起局部作用并影響炎癥、侵襲、分化、增殖和細(xì)胞粘附等過(guò)程。PRP活化后不僅可釋放TNF、PDGF、VEGF等生長(zhǎng)因子，還可釋放三種抗炎因子(IL-4、IL-13、IFN-a)及三種促炎因子(IL-8、IL-17、TNF-a)，這些炎癥介質(zhì)相互作用，維持母胎平衡。宮腔輸注PRP后檢測(cè)到子宮內(nèi)膜組織中IL-1β、IL-4、IL-10表達(dá)增加，IL-6表達(dá)減少[27]，故PRP改善子宮內(nèi)膜容受性的另一個(gè)可能機(jī)制是影響母胎界面的炎癥反應(yīng)。臨床上，Sfakianoudis K利用PRP療法協(xié)助慢性子宮內(nèi)膜炎患者實(shí)現(xiàn)有效的IVF周期并成功妊娠[30]。因此，PRP可通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性降低RIF率。

3.2 通過(guò)增加卵巢儲(chǔ)備提高卵巢反應(yīng)性

卵巢儲(chǔ)備低下可降低卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)，導(dǎo)致可利用的卵母細(xì)胞和胚胎數(shù)量減少，最終降低IVF成功率。PRP富含的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子參與組織再生和愈合的過(guò)程，不僅可促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育，還可提高卵巢對(duì)促性腺激素的親和力，由此改善卵巢在IVF周期中的反應(yīng)性。

PDGF廣泛存在于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，并起到激活原始卵泡的作用；GDF-9對(duì)卵泡生長(zhǎng)的所有階段均有效，可增加原始卵泡與腔前卵泡的數(shù)量。此外，在卵泡發(fā)育期間，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可促進(jìn)卵巢形成新的血管，卵泡血流量的增加豐富了氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中抗凋亡蛋白的表達(dá)來(lái)預(yù)防濾泡閉鎖，由此增強(qiáng)了其對(duì)促性腺激素的反應(yīng)能力[31]。而且，血流的改善可誘導(dǎo)卵巢干細(xì)胞的分化，從而發(fā)育出新的卵母細(xì)胞并促進(jìn)卵巢再生[32]。Marzie Farimani在卵巢反應(yīng)不良的女性卵巢內(nèi)注射PRP后觀察到，PRP注射后卵母細(xì)胞的平均數(shù)量明顯多于注射前，并首次報(bào)道了卵巢反應(yīng)不良患者在經(jīng)PRP治療后的三例活產(chǎn)[33]。故PRP可通過(guò)增加卵巢儲(chǔ)備并增強(qiáng)其對(duì)促性腺激素的反應(yīng)能力來(lái)提高卵巢反應(yīng)性。

4 結(jié)語(yǔ)

本文總結(jié)了PRP在改善女性卵巢功能及IVF結(jié)局中所發(fā)揮的潛在作用機(jī)制。盡管PRP在女性生殖系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但迄今為止，關(guān)于PRP是否廣泛應(yīng)用于婦產(chǎn)科相關(guān)疾病的防治仍存在諸多爭(zhēng)議。PRP的優(yōu)越性在于取材便捷、制作成本較低，因其可來(lái)源于自體血漿，故可避免發(fā)生疾病播散及免疫排斥反應(yīng)，且目前在臨床應(yīng)用過(guò)程中尚未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的不良反應(yīng)。而它的局限性在于至今并未形成統(tǒng)一的制作及最佳應(yīng)用濃度標(biāo)準(zhǔn)，且許多作用機(jī)制仍不明確，因此尚需大量的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)它的療效。