促性腺激素對(duì)動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟中的作用研究進(jìn)展

張雨陽(yáng)，金 一

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

繁殖性能是雌性動(dòng)物重要的生產(chǎn)力因素。為了提高動(dòng)物繁殖率，選取生產(chǎn)性狀優(yōu)良的個(gè)體進(jìn)行卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是必然選擇。將卵泡內(nèi)未成熟卵母細(xì)胞取出，在體外特殊條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得成熟卵子完成體外受精的過(guò)程稱(chēng)為卵母細(xì)胞體外成熟。一般來(lái)說(shuō)，為了更好地模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的環(huán)境并處理好各個(gè)成分之間的關(guān)系，必須要向培養(yǎng)體系中添加激素。激素是卵母細(xì)胞核成熟的最重要調(diào)節(jié)因子，特別是促性腺激素是哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)核成熟的主要調(diào)節(jié)器。促性腺激素包括促甲狀腺激素（FSH）和促黃體素（LH），其在卵泡成熟過(guò)程中起重要作用，在體內(nèi)調(diào)節(jié)卵泡的正常發(fā)育和誘導(dǎo)排卵，但在體外培養(yǎng)過(guò)程中仍有些機(jī)制尚不明確。本文主要綜述促性腺激素在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中的作用和在減數(shù)分裂過(guò)程中的影響，為哺乳動(dòng)物繁殖育種提供理論依據(jù)。

1 卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)

卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的生物學(xué)定義是將未成熟的GⅤ期卵母細(xì)胞從竇卵泡中取出并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系中培養(yǎng), 使其可以在體外成熟到MⅡ期?，F(xiàn)階段關(guān)于體外成熟與體內(nèi)成熟之間的研究成果顯示，體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞與體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育的胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)沒(méi)有顯著差異，表明體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞與體外成熟卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育潛能可能沒(méi)有差異[1]。體內(nèi)和體外成熟卵母細(xì)胞的透明帶雙折射和減數(shù)分裂紡錘體差異不顯著[2]。此外，體內(nèi)和體外成熟的卵母細(xì)胞顯示正常的卵漿，細(xì)胞器分布均勻[3]。線(xiàn)粒體形態(tài)在成熟條件之間表現(xiàn)出相似性。在體內(nèi)和體外成熟的卵母細(xì)胞中，皮質(zhì)顆粒通常分層成一排，大部分連續(xù)排列在卵漿下方。有人提出預(yù)先培養(yǎng)未成熟卵母細(xì)胞，使其保持在減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，可以改善細(xì)胞質(zhì)成熟，從而提高體外成熟卵母細(xì)胞的最終發(fā)育能力[4]。因此，研究促性腺激素在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的作用，能為卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)改善細(xì)胞質(zhì)提高卵母發(fā)育能力提供理論依據(jù)。

2 促性腺激素在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中作用

2.1 促卵泡素

促卵泡素（FSH）是決定卵泡在培養(yǎng)中存活和生長(zhǎng)的主要激素。FSH有利于促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和質(zhì)量，導(dǎo)致更高的胚胎卵裂率和更低的妊娠損失率[5]。理論上，在卵泡或黃體階段開(kāi)始時(shí)使用卵泡刺激素引發(fā)可以增強(qiáng)體內(nèi)未成熟卵母細(xì)胞的卵泡發(fā)育和成熟能力[6]。卵母細(xì)胞存活率與激素添加量之間存在時(shí)間依賴(lài)性，培養(yǎng)后期向培養(yǎng)基中添加FSH 會(huì)導(dǎo)致活卵泡數(shù)量的減少。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，卵泡存活率對(duì)培養(yǎng)基中FSH 濃度的依賴(lài)不明顯，但有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，卵泡生長(zhǎng)在激素含量高的培養(yǎng)基中更強(qiáng)烈[7]。Kreeger 等在試驗(yàn)結(jié)果表明，含F(xiàn)SH 10 和25 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑明顯大于含F(xiàn)SH 0 或5 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑，F(xiàn)SH 劑量的增加也增加了乳酸的積累，這表明激活了顆粒細(xì)胞代謝。然而，非常高劑量的FSH（50 mU·mL-1）導(dǎo)致卵泡存活率下降，因?yàn)榇x產(chǎn)物積累得太快[8]。研究證實(shí)，無(wú)論卵母細(xì)胞數(shù)量多少，隨著FSH 劑量的增加，活產(chǎn)率都顯著降低[9]。

2.2 促黃體生成素

促黃體生成素（LH）在卵泡成熟過(guò)程中起重要作用。LH 總是存在于體內(nèi)通過(guò)獲得足以使卵泡成熟的濃度來(lái)刺激體內(nèi)的卵泡生成[10]。LH 刺激卵泡細(xì)胞的雄激素合成[11]。LH 并沒(méi)有被認(rèn)為是培養(yǎng)基的必要成分，但目前正在積極討論其對(duì)體外卵泡生長(zhǎng)的影響的問(wèn)題[12]。

LH 峰激活負(fù)責(zé)卵丘細(xì)胞外基質(zhì)形成和穩(wěn)定的基因，即激活卵母細(xì)胞的竇狀卵泡壁區(qū)域。LH 峰導(dǎo)致卵丘細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子（EGF）家族基因（Areg、Ereg 和BTC）表達(dá)迅速增加。這些配體是完整的膜蛋白，通過(guò)胞外裂解從細(xì)胞表面釋放出來(lái)。然后這些配體與EGF 受體（EGFR）結(jié)合并激活受體。此外，這種結(jié)合導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3 和MAPK1 的激活，也被分別稱(chēng)為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）。ERK1/2可刺激卵母細(xì)胞成熟。然而，EGF網(wǎng)絡(luò)和ERK1/2在排卵調(diào)節(jié)、卵母細(xì)胞成熟和進(jìn)一步卵泡黃素化中的具體作用還不夠清楚[13-14]。

LH 對(duì)卵泡體外成熟影響的研究表明，在添加LH的培養(yǎng)基中，卵泡存活率明顯高于不添加LH的培養(yǎng)基。在低劑量LH 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡比在高LH 濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑更大[15]。當(dāng)LH 濃度＞5 U·L-1時(shí)，顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，卵泡發(fā)生閉鎖或黃素化。此外，由于LHCGR mRNA的加速降解，高水平的LH 導(dǎo)致LHCGR 的產(chǎn)量和敏感性下降[16]。促性腺激素刺激引起孕激素受體發(fā)生變化，加速子宮內(nèi)膜的成熟；高水平的FSH 或雌激素可能增加顆粒細(xì)胞對(duì)LH 的敏感性。這種變化使黃體生成素即使在低LH 水平下也能被誘導(dǎo)。黃體化導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的早期成熟[17]。

3 促性腺激素與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的關(guān)系

卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)SH 和LH 與顆粒細(xì)胞上的受體結(jié)合并激活環(huán)腺苷酸系統(tǒng)（cAMP），cAMP通過(guò)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞pKa依賴(lài)性磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1抑制減數(shù)分裂促進(jìn)因子的活性而維持減數(shù)分裂停止[18]。FSH 誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，暫時(shí)性抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)成熟，隨后LH 形成排卵峰，使顆粒細(xì)胞中cAMP 的含量上升，卵母細(xì)胞中cAMP 含量下降，減數(shù)分裂恢復(fù)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，卵丘細(xì)胞數(shù)量增加，卵泡破裂和黃體化[19]。一旦誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的分子和結(jié)構(gòu)事件，從減數(shù)分裂和生發(fā)泡破裂的恢復(fù)開(kāi)始，最終在減數(shù)分裂的第2個(gè)中期阻止卵母細(xì)胞。

LH在體內(nèi)成熟過(guò)程中降低了顆粒細(xì)胞中NPPC和NPR2 的含量，繼而導(dǎo)致cGMP 水平下降，引起MPF 活化，恢復(fù)了減數(shù)分裂[20-21]。顆粒cGMP 濃度的降低促進(jìn)cGMP 通過(guò)縫隙連接從卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞向外顆粒細(xì)胞層擴(kuò)散，使cGMP 濃度在卵泡內(nèi)均勻降低[22-23]。卵內(nèi)cGMP含量過(guò)低從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞PDE3A活化、cAMP水解、PKA失活和MPF激活使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)[24]。但在體外培養(yǎng)的小鼠壁顆粒細(xì)胞中，LH 不能引起NPPCmRNA 和cGMP含量降低[25]。而FSH 在體外培養(yǎng)卵泡時(shí)能起到類(lèi)似于LH在卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟中的作用，下調(diào)NPPC含量[26]。也有試驗(yàn)表明，F(xiàn)SH主要通過(guò)E2 及其受體間接促進(jìn)了顆粒細(xì)胞中NPPC 的表達(dá)發(fā)揮作用[27]。此外，F(xiàn)SH調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的翻譯是通過(guò)EGFR[28]。

FSH 和LH 相應(yīng)的受體與相匹配的配子結(jié)合后通過(guò)顆粒細(xì)胞中的cAMP 通路轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果。一種假設(shè)是FSH 受體、LH 受體與其他信號(hào)通路耦聯(lián)，導(dǎo)致產(chǎn)生不同結(jié)果，另一種假設(shè)是FSH和LH 刺激顆粒細(xì)胞時(shí)cAMP 的特性和傳播產(chǎn)生不同作用[29]。因此促性腺激素在cAMP 通路中對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用機(jī)制還需要深入研究。

4 小 結(jié)

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)是一項(xiàng)很有前途的技術(shù)，但目前還不能滿(mǎn)足當(dāng)前生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的需要。選擇獲得體外成熟卵母細(xì)胞所需的最佳卵泡培養(yǎng)條件需要一個(gè)復(fù)雜的方法，需要考慮細(xì)胞的機(jī)械和化學(xué)環(huán)境、新陳代謝和旁分泌相互作用[30-31]。為了獲得更多的成熟卵母細(xì)胞，需要用對(duì)卵泡正常生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要的因素（包括促性腺激素）進(jìn)行研究。在大多數(shù)研究中，F(xiàn)SH 是在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中添加到培養(yǎng)基中的，而具有LH 活性的藥物僅在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)添加。在少數(shù)的幾項(xiàng)研究中，為了要保持卵泡的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，研究人員不僅在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)向培養(yǎng)基中添加LH 以刺激排卵，還在非常早期階段添加了LH。因此，正確應(yīng)用促性腺激素可以在體外模擬體內(nèi)條件。研究促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的維持作用對(duì)卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育的影響仍然是許多研究人員面臨的主要問(wèn)題。