獺兔腸道菌群的研究進展

時云朵，孫 豪

（1.四川省水產學校，成都 611730；2.雅安市農業(yè)農村局，四川 雅安 625000）

獺兔原產于法國科倫地區(qū)，1920年由傳教士帶入我國，并于2002年由四川省草原科學研究院育成四川白獺兔種系，是一種皮肉兼用的重要經濟動物，也是一種常用的試驗模式動物[1]。動物的胃腸道，棲息著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物[2]。在長期的進化過程中，這些微生物與宿主形成一個相互依賴、相互制約的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群對宿主的免疫、代謝、疾病甚至行為等方面均存在一定聯(lián)系[3]。獺兔的盲腸具有瘤胃般的作用，其中的微生物能幫助腸道進行食物消化[1]。在獺兔養(yǎng)殖中，飼料改變、氣候變化、過量使用抗生素類藥等均可導致其腸道菌群失調，引起腹瀉[4]。目前，腹瀉等消化道疾病己成為獺兔主要的疾病之一[5]。為促進獺兔養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展，現(xiàn)就獺兔道菌群結構及抗生素、益生菌、中藥等對獺兔腸道菌群影響進行概述，以期為獺兔養(yǎng)殖的科學用藥和微生態(tài)制劑在獺兔養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 獺兔腸道菌群結構

1.1 活菌計數(shù)法研究獺兔腸道菌群結構

活菌計數(shù)法是研究獺兔腸道菌群的重要方法之一，主要采用特殊培養(yǎng)基，對獺兔胃腸道中可培養(yǎng)菌進行活菌計數(shù)研究。劉亞娟等采用活菌計數(shù)法研究斷奶獺兔盲腸菌群，發(fā)現(xiàn)其盲腸中乳酸桿菌數(shù)量達107.65cfu·g-1、雙歧桿菌數(shù)量達107.72cfu·g-1和大腸桿菌數(shù)量達106.79cfu·g-1，并認為一定濃度的葡萄糖氧化酶能顯著提高盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量、降低大腸桿菌數(shù)量[6]。同樣，吳峰洋等也采用活菌計數(shù)法研究了斷奶獺兔盲腸菌群中乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量和大腸桿菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)每克盲腸內容物3種菌的數(shù)量與劉亞娟等的研究結果在同一個數(shù)量級，并認為魔芋甘露寡糖能改善獺兔盲腸菌群組成[6-7]。而左曉磊等采用活菌計數(shù)法發(fā)現(xiàn)獺兔盲腸中乳酸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌數(shù)量分別達 108.06、107.99、105.65、104.93cfu·g-1，其中乳酸桿菌、大腸桿菌的數(shù)量與上述兩項研究結果高一個數(shù)量級，這可能與不同的基礎日糧有關系[8]。此外，齊聰巖等采用活菌計數(shù)法研究了獺兔盲腸菌群，發(fā)現(xiàn)其盲腸中含有大量的大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌，且處于動態(tài)變化中，并認為發(fā)酵玉米秸稈可降低大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌的數(shù)量，最終改善腸道微生態(tài)環(huán)境[9]。從上述研究可見，采用活菌計數(shù)法研究獺兔腸道菌群結構主要集中在飼料添加物對其盲腸中常見的幾種可培養(yǎng)菌的研究上，未見采用此方法直接研究獺兔腸道菌群的報道，且鮮見對獺兔全腸道或軟硬糞便菌群的研究，說明采用活菌計數(shù)法研究獺兔腸道菌群中只能集中在點上，不能全面反映腸道菌群結構。

1.2 分子鑒定法研究獺兔腸道菌群結構

分子鑒定方法是基于16SrDNA 擴增菌群核酸序列，最終以圖譜形式進行展示、比較分析或結合克隆測序反映獺兔胃腸道菌群結構。Guo等采用16SrRNA反轉錄克隆測序法成功鑒定一株源于獺兔腸道的細菌為雙鏈球菌[10]。任傳帥等根據(jù)細菌16SrDNA 的V3 可變區(qū)基因序列設計特異性引物，采用實時熒光定量PCR 技術研究了獺兔十二指腸、空腸、回腸和盲腸腸壁中的菌群結構，揭示了32 日齡和46 日齡獺兔各腸壁中擬桿菌、梭菌屬、韋榮球菌和大腸埃希菌的定植量，并認為獺兔的軟糞液和小腸液對擬桿菌、梭菌屬、韋榮球菌的定植有促進作用，而對大腸埃希菌的定植影響較小[11]。周毅等采用PCR-DGGE 和Real-Time PCR技術比較分析健康與腹瀉獺兔盲腸菌群結構的差異，發(fā)現(xiàn)健康與腹瀉獺兔盲腸菌群豐富度、多樣性指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但腹瀉獺兔盲腸菌群結構有復雜化的趨勢；腹瀉獺兔盲腸菌群中普雷沃氏菌、梭菌類群Ⅰ數(shù)量與健康獺兔的差異不大，而鏈球菌屬、梭菌類群Ⅳ和ⅩⅣa、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、普拉梭桿菌等有益菌數(shù)量顯著降低，埃希氏大腸桿菌數(shù)量顯著升高，認為獺兔發(fā)生腹瀉后盲腸有益菌數(shù)量降低，有害菌數(shù)量升高；同時，還分析了獺兔十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群結構，發(fā)現(xiàn)獺兔從十二指腸到盲腸的菌群豐富度呈“V”字形變化，空腸中菌群豐富度最低[12-13]。從上述研究可見，多種分子鑒定法已廣泛應用于獺兔腸道菌群研究中，可更快速、更直觀、更全面展示獺兔腸道菌群結構，加深人們對獺兔腸道菌群的認識，但不能全面量化反映菌群結構及代謝關系等。

1.3 高通量測序研究獺兔腸道菌群結構

近年來，隨著二代測序技術的迅猛發(fā)展，高通量測序方法被用于獺兔腸道菌群研究中，使得人們對其腸道菌群有了更深入的了解。Zeng 等首次采用高通量測序方法對比分析不同糞便類型（硬糞和軟糞）的菌群結構，并揭示兔獺糞便菌群與宿主體重的關系，發(fā)現(xiàn)獺兔的糞便菌群主要為擬桿菌屬、梭菌屬、瘤胃菌科、疣微菌科、柔膜細菌目、瘤胃球菌屬、毛螺菌科、腸桿菌科、藍藻細菌等的細菌，不同體重獺兔的硬糞菌群結構差異較大，高體重獺兔硬糞菌群中有41 種菌顯著低于低體重的（如擬桿菌、乳酸菌、普雷沃斯菌等，P＜0.05），但軟糞菌群結構在高低體重間差異不顯著（P＞0.05），同時高體重獺兔的軟糞菌群中有44 種菌顯著高于硬糞的（如瘤胃菌科、疣微菌科）等細菌，有7種在硬糞中豐富度更高；對差異菌群功能基因進行預測分析發(fā)現(xiàn)，高體重獺兔α-亞麻酸代謝、芪類/二芳基庚烷/姜辣素生物合成代謝途徑豐度高于低體重的，且高體重獺兔軟糞中有4種與有毒物質（如二甲苯、二噁英等）降解有關的代謝途徑豐富度更高；獺兔的軟糞菌群中有26條路徑（如各種N-聚糖生物合成）更為豐富，獺兔的硬糞菌群中僅有4條途徑更為豐富，此研究系統(tǒng)揭示了獺兔糞便菌群多樣性及其與體重的關系[14-15]。高通量測序方法不能區(qū)分死菌與活菌，為了解獺兔胃腸道的總菌與活菌的差異，F(xiàn)u 等采用改進的單疊氮丙啶試驗結合二代測序的方法比較分析了獺兔胃、空腸、回腸、盲腸和結腸的總菌與活菌間的差異，發(fā)現(xiàn)其前腸菌群具有非常低的活菌比例（胃、空腸和回腸中分別僅有1.12%、1.2%和2.84%），其后腸具有非常高的活菌比例（盲腸中有24.66%，結腸中有19.08%）；梭菌屬、瘤胃菌科等3 種菌群是后腸中的最優(yōu)勢菌群，豐度雖發(fā)生了改變，但優(yōu)勢順序未發(fā)生改變[16]。而在前腸菌群中，不僅菌群豐度發(fā)生了改變，優(yōu)勢順序也發(fā)生了改變，不動桿菌屬菌群變?yōu)樽顑?yōu)勢的菌群，α多樣性和β多樣性也存在顯著差異，通過網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)總菌與活菌的菌群結構幾乎完全不同，認為獺兔胃腸道中的總菌不能代表活菌，尤其在獺兔的前腸菌群研究中[17]。上述研究發(fā)現(xiàn)，高通量測序方法使得人們對獺兔腸道菌群有更深入的認識，揭示腸道菌群與宿主部分代謝途徑的關系，并提出利用高通量測序方法研究腸道菌群的注意事項，但對于獺兔胃腸道中活菌比例總體較低的研究，可能與胃腸道中許多微生物是“見光死”有關。Fu 等的試驗樣品是從死后獺兔胃腸道中取出內容物，并不能排出菌群是離開腸道后死亡的可能，其研究結果中總菌和活菌的菌群結構完全不同也可能佐證了較大一批微生物是離開胃腸道后死亡的，因此，獺兔胃腸道中總菌能否代表活菌及其比例有待進一步研究[16]。同時，菌群間、菌群與宿主間的相互作用機制，仍需多學科、多組學進一步研究。

2 抗生素、微生態(tài)制劑在獺兔中的應用研究

2.1 抗生素對獺兔腸道菌群影響研究

動物飼料中添加抗生素必將被逐漸取消，但為了在獺兔養(yǎng)殖中科學使用抗生素，大量研究報道了多種抗生素作為飼料添加劑對獺兔腸道菌群的影響。鄒芙沁等采用PCR-DGGE 和熒光定量PCR方法研究了桿菌肽鋅對斷奶獺兔盲腸菌群的影響，發(fā)現(xiàn)桿菌肽鋅對獺兔盲腸菌群豐富度、多樣性和均勻度等影響不大，但能顯著降低梭菌類群ⅩⅣa 的數(shù)量，認為桿菌肽鋅作為斷奶獺兔飼料添加劑，對其盲腸菌群結構沒有顯著影響[18]。同時，楊明月等也采用了相同方法研究了硫酸粘桿菌素對斷奶獺兔盲腸菌群的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸粘桿菌素對獺兔盲腸菌群多樣性影響不大，但能顯著提高梭菌類群ⅩⅣa、腸球菌屬、鏈球菌屬豐度，顯著降低梭菌類群Ⅳ的豐度，認為一定濃度的硫酸粘桿菌素不能引起獺兔盲腸菌群失調[19]。此外，文斌等也采用上述方法分析金霉素對斷奶獺兔盲腸菌群的影響，發(fā)現(xiàn)金霉素對獺兔盲腸菌群結構和多樣性等影響不大，但能顯著提高普雷沃氏菌屬數(shù)量，推測金霉素的添加可能促進獺兔的體重增長[20]。Zou等采用高通量測序方法分析了桿菌肽鋅、硫酸粘桿菌素和金霉素對斷奶獺兔盲腸菌群的影響，發(fā)現(xiàn)獺兔盲腸中的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門的細菌，其次是擬桿菌門的細菌；金霉素組盲腸菌群中擬桿菌門與厚壁菌門的比值比桿菌肽鋅組的更高，桿菌肽鋅組的變形桿菌門和乳酸桿菌屬細菌豐度顯著降低，而硫酸粘桿菌素組的乳酸桿菌屬細菌豐度顯著提高；此外，硫酸粘桿菌素組和桿菌肽鋅組的優(yōu)勢菌群均為瘤胃球菌屬，尤以白色瘤胃球菌為主，桿菌肽鋅組的糞球菌比例顯著升高，金霉素組與對照組的盲腸菌群結構相似，認為抗生素的使用可能導致獺兔盲腸菌群發(fā)生變化，并推測獺兔盲腸菌群對金霉素存在較高耐藥性[21]。上述研究發(fā)現(xiàn)，部分抗生素可作為獺兔飼料添加劑，但應注意添加劑量，并嚴格監(jiān)控耐藥性。

2.2 益生菌對獺兔腸道菌群影響研究

益生菌是抗生素的重要替代品。大量研究表明，益生菌可改善獺兔胃腸道菌群結構，促進其生長發(fā)育[22-26]。Wang等比較分析兩株乳酸桿菌對斷奶獺兔十二指腸、空腸和盲腸中菌群結構的影響，乳酸菌可改變獺兔腸道菌群，特別是盲腸內的微生物多樣性和豐度，認為應用合適的乳酸菌可調節(jié)獺兔腸道微生態(tài)系統(tǒng)[27]。同樣，Zhou等研究不同濃度的布氏乳桿菌對斷奶獺兔腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的布氏乳桿菌均可顯著提高獺兔十二指腸、空腸、盲腸的菌群香農指數(shù)、豐富度和均勻度，僅低濃度的布氏乳桿菌可顯著提高回腸的菌群香農指數(shù)、豐富度和均勻度，且不同濃度的布氏乳桿菌均可提高十二指腸、空腸、回腸中菌群的豐度，并不同程度的抑制大腸桿菌的豐度，認為布氏乳桿菌能增加獺兔腸道菌群豐富度，提高有益菌群數(shù)量，抑制部分有害細菌增殖，適量添加布氏乳桿菌有助于提高獺兔飼料利用率[13]。此外，Liu 等研究不同濃度的丁酸梭菌對斷奶獺兔腸道菌群的影響，此試驗是從懷孕獺兔開始飼喂不同濃度的丁酸梭菌，待其產子斷奶后，對斷奶獺兔繼續(xù)飼喂對應濃度的丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌能增加斷奶獺兔腸道中益生菌群豐度，認為其可改善獺兔腸道微生物群[28]。上述研究可見，所用益生菌均非獺兔源益生菌，提示獺兔源益生菌的篩選應用研究有待進一步加強[29-31]。

2.3 中草藥等對獺兔腸道菌群影響研究

近年來，有大量研究表明中草藥可改善獺兔胃腸道菌群結構[32-35]。吳峰洋等研究了魔芋甘露寡糖對生長獺兔腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的魔芋甘露寡糖均能降低盲腸中大腸桿菌數(shù)量，提高雙歧桿菌豐度，并呈現(xiàn)濃度依耐性，且能提高乳酸菌含量，認為魔芋甘露寡糖能改善獺兔盲腸菌群組成[7]。同時，左曉磊等研究不同水平的純中藥飼料添加劑對生長獺兔腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)中草藥可顯著降低獺兔的腹瀉率，能抑制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有害菌增殖，調節(jié)乳酸桿菌等有益菌的代謝，認為中草藥可促進生長獺兔腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[8]。此外，孫海濤等研究玉屏風多糖合生元對斷奶獺兔腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)玉屏風多糖和玉屏風多糖合生元均能顯著提高獺兔空腸和回腸中菌群多樣性和總菌、擬桿菌門、厚壁菌門、普雷沃氏菌屬、丁酸弧菌和梭菌類型的豐度、降低腸球菌屬數(shù)量，認為玉屏風多糖和玉屏風多糖合生元可改善獺兔空腸和回腸菌群結構[32]。上述研究可見，中草藥在獺兔養(yǎng)殖上的應用研究較多，但具體機制等有待進一步研究。

3 小 結

獺兔是一種皮肉兼用的小型草食動物，具有較高的經濟價值。經過多年的研究，已初步認識了獺兔腸道菌群的基本構成及與部分代謝途徑的關系，然而還鮮見獺兔源益生菌的篩選應用研究，且菌群間、菌群與宿主間的相互作用機制，中草藥改善獺兔菌群結構的作用機制，以及腸道中真菌、古細菌、病毒等微生物的研究，均需多學科、多組學進一步研究。