活血止痛方調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的影響

邵榮學(xué) 周輝 潘浩 樂軍 陳寶英

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以關(guān)節(jié)及周圍滑膜的增生、肥厚，軟骨的降解、破壞，軟骨下骨的囊性變、繼之硬化，邊緣性骨贅形成等為病理改變，以關(guān)節(jié)腫痛、僵硬、活動(dòng)受限為臨床表現(xiàn)的一種常見疾?。?］。其中以膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）最為常見，而KOA的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。有研究表明，活血止痛方能夠有效緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等癥狀，促進(jìn)關(guān)節(jié)功能恢復(fù)［2］。但其作用機(jī)制尚未明確，有研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育、骨化、重塑、骨折修復(fù)等，參與KOA的發(fā)生與發(fā)展［3-7］。2018年6月至2019年3月作者通過建立KOA大鼠模型，探討活血止痛方保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，6個(gè)月齡，體重280～310g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為中藥組、模型組和對(duì)照組，每組12只，用體積分?jǐn)?shù)4%的水合氯醛（1ml/l00g）腹腔注射麻醉，中藥組和模型組采用改良Hulth法［8］復(fù)制KOA模型；對(duì)照組切開膝關(guān)節(jié)處皮膚、打開關(guān)節(jié)腔，不切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，不摘除內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)后連續(xù)3d，每天用碘伏消毒所有大鼠手術(shù)切口、且予以2萬U青霉素肌肉注射預(yù)防感染早晚各1次。術(shù)后第4天開始，強(qiáng)迫大鼠跑步0.5h/d，連續(xù)4周。

1.2 藥物制備及干預(yù) 術(shù)后第5周開始中藥組灌服活血止痛方湯藥進(jìn)行治療，灌服量為2ml/（次·d），模型組和對(duì)照組灌服等量的生理鹽水，1次/d，直到取材。其中活血止痛方（赤芍藥12g，紅花3g，川穹10g，當(dāng)歸12g，三七6g，紫金藤15g，蘇木10g，積雪草6g，地鱉蟲10g，陳皮10g，丹參10g，乳香10g），其提取物按照人與大鼠體表面積折算，含生藥量0.8377g/ml（由杭州市中醫(yī)院制劑室提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；電子天平（Startorius，德國(guó)）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器（SZ-93，上海亞榮生化儀器廠）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；冰凍切片機(jī)（AO，美國(guó)）等。

1.4 觀察指標(biāo)（1）大體觀察：術(shù)后第8、12周，每組隨機(jī)取6只大鼠。乙醚誘導(dǎo)麻醉，斷頸法處死大鼠，解剖膝關(guān)節(jié)。肉眼觀察膝關(guān)節(jié)軟骨表面及關(guān)節(jié)邊緣改變、滑膜炎性改變。KOA的判斷方法：肉眼大體觀察，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］，由與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的同一組人員，采用盲法評(píng)分。見表1。（2）Mankin評(píng)分：將上述標(biāo)本按照文獻(xiàn)報(bào)道的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［10］，由與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的同一組人員，采用盲法進(jìn)行半定量評(píng)分，計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的總分。見表2。（3）病理形態(tài)學(xué)觀察：將上述膝關(guān)節(jié)標(biāo)本從股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端同軟骨下骨切下，按脫鈣操作程序常溫脫鈣6周，更換脫鈣液1次/2周。脫鈣完成后，取內(nèi)側(cè)半脛骨關(guān)節(jié)面，修成1.5mm×1.5mm×2.5mm的組織塊。冷凍切片機(jī)箱內(nèi)溫度-25℃，片厚10μm下連續(xù)切片，室溫晾干，然后行蘇木精/番紅-O/固綠復(fù)染。病理切片干燥后，進(jìn)行倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。（4）軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá)：將上述膝關(guān)節(jié)標(biāo)本從股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端同軟骨下骨切下，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同取材時(shí)期各組SD大鼠軟骨組織中β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13、TNF-α基因的表達(dá)量，其RT-PCR 引物序列見表3。

表1 關(guān)節(jié)軟骨病變大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 Mankin軟骨組織形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 基因RT-PCR 引物序列表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后第8周剖開右膝關(guān)節(jié)：中藥組和對(duì)照組見軟骨表面光滑，色澤正常，軟骨大體評(píng)分為0分（見圖1A）；模型組見滑膜增生明顯，軟骨失去正常光澤，關(guān)節(jié)面粗糙，呈磨損性變，軟骨缺損，關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨大體評(píng)分為1～2分（見圖1B）。術(shù)后第12周：中藥組見滑膜輕度充血水腫，軟骨表面色暗紅，失去正常光澤，軟骨表面欠光滑但尚平整，軟骨大體評(píng)分為0～1分（見圖1C）；模型組膝關(guān)節(jié)腫脹變形，關(guān)節(jié)活動(dòng)不利，膝關(guān)節(jié)滑膜呈結(jié)節(jié)樣增生，軟骨失去正常光澤，關(guān)節(jié)面粗糙，呈磨損性變，軟骨剝脫，軟骨下骨暴露，關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨大體評(píng)分為3～4分（見圖1D）；對(duì)照組見軟骨表面光整，色澤正常，軟骨大體評(píng)分為0分。

圖1 術(shù)后8、12周關(guān)節(jié)情況

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后第8周：中藥組見滑膜組織細(xì)胞呈單層排列，滑膜下毛細(xì)血管未見增生，間質(zhì)無明顯水腫，偶見少量單核、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖2A）；軟骨形態(tài)正常，軟骨細(xì)胞各層次排列規(guī)則、分布均勻，表面光整，潮線清晰，細(xì)胞呈柱狀排列，偶見表層軟骨變薄，呈裂隙樣改變（見圖2B）。模型組見滑膜細(xì)胞增生明顯，可見炎性浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域可見單核細(xì)胞浸潤(rùn)以及細(xì)胞凋亡，滑膜下層毛細(xì)血管增生明顯，可見結(jié)締組織增生（見圖2C）；軟骨表面紊亂，失去正常光澤，可見軟骨表層剝脫，呈絨毛狀，其軟骨細(xì)胞柱狀排列消失，有細(xì)胞簇出現(xiàn)，軟骨下骨未見明顯異常改變（見圖2D）。sham組滑膜組織細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫，滑膜下毛細(xì)血管未見增生，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；軟骨形態(tài)正常，軟骨細(xì)胞各層次排列規(guī)則、分布均勻，表面光整，潮線清晰。術(shù)后第12周：中藥組見滑膜輕度增厚，間質(zhì)輕度水腫，有少量單核、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜下層毛細(xì)血管輕度增生，偶見纖維化（見圖3A）；關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)輕度破壞，軟骨表層染色減少，無明顯破裂或大片失染，偶見潮線中斷、軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，骨小梁結(jié)構(gòu)基本完整（見圖3B）。模型組見滑膜細(xì)胞增生明顯，并可見明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞，滑膜下毛細(xì)血管增生，纖維化明顯（見圖3C）；關(guān)節(jié)軟骨剝脫、粗糙，軟骨細(xì)胞凋亡明顯、殘存軟骨細(xì)胞排列雜亂，骨小梁的結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨下骨增生硬化（見圖3D）。對(duì)照組的結(jié)果與第8周相似。

圖2 術(shù)后8周關(guān)節(jié)病理

圖3 術(shù)后12周關(guān)節(jié)病理

2.3 軟骨大體評(píng)分和Mankin評(píng)分 對(duì)照組軟骨大體評(píng)分和Mankin評(píng)分均為“0”分，其他兩組的軟骨大體評(píng)分和Mankin評(píng)分隨著時(shí)間變化而增高，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中藥組評(píng)分均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組軟骨大體評(píng)分、Mankin評(píng)分（±s）

表4 各組軟骨大體評(píng)分、Mankin評(píng)分（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05

組別 時(shí)間（周） n 軟骨大體評(píng)分（分） Mankin評(píng)分（分）中藥組 8 6 1.00±0.63*# 2.50±1.05*#模型組 8 6 1.83±0.75# 5.33±1.03#對(duì)照組 8 6 0 0中藥組 12 6 2.16±0.75*# 6.83±1.47*#模型組 12 6 3.33±0.82# 9.67±1.21#對(duì)照組 12 6 0 0

2.4 軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá) 不同時(shí)間點(diǎn)模型組β-catenin、MMP-13和TNF-α基因mRNA的表達(dá)量均高于中藥組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組β-catenin、MMP-13和TNF-α基因表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，中藥組、模型組和對(duì)照組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)膝關(guān)節(jié)軟骨中均檢測(cè)到β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá)，不同時(shí)間點(diǎn)模型組上述基因mRNA的表達(dá)量均高于中藥組和對(duì)照組；中藥組上述基因表達(dá)量均高于對(duì)照組。正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原組成，基質(zhì)金屬蛋白酶家族由鋅肽鏈內(nèi)切酶組成，能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原。其中MMP-13廣泛存在于骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型膠原的作用較強(qiáng)，被認(rèn)為是裂解Ⅱ型膠原作用最強(qiáng)的酶［11］。TNF-α是關(guān)節(jié)炎病理改變過程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要細(xì)胞因子［12］。其能夠刺激蛋白多糖的消耗和膠原網(wǎng)絡(luò)的損傷并減少軟骨基質(zhì)蛋白的合成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、尤其是MMP-13的高表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)內(nèi)膠原的降解，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜皺襞增生、炎癥進(jìn)展，改變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡；改變軟骨中膠原成分，造成關(guān)節(jié)軟骨生存的微環(huán)境惡化，促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎加重［13-16］。上述研究與本資料結(jié)果一致，β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá)參與KOA 的產(chǎn)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)中藥組膝關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達(dá)量均低于模型組，從而證實(shí)活血止痛方藥能延緩KOA的進(jìn)展。

盡管近年來對(duì)KOA的研究取得較多成績(jī)，但其發(fā)生和發(fā)展機(jī)制仍知之甚少。前期研究證實(shí)典型的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)KOA發(fā)病機(jī)制之一。主要病理特征為軟骨基質(zhì)退化、軟骨下骨改變和軟骨周圍骨贅形成等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬和疼痛。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，活血止痛方能保護(hù)或修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，重塑細(xì)胞的衰老平衡穩(wěn)態(tài)，延緩關(guān)節(jié)病損，促進(jìn)病損關(guān)節(jié)的康復(fù)，其機(jī)制可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨有關(guān)，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。