經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

余柯達(dá) 毛佳婷 師帥 鄒立波 劉鴻 江文嬌

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來(lái)源于胚胎發(fā)育的中胚層，具有自我更新和多向分化潛能等特點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。MSCs幾乎存在于所有的器官和組織中。自1957年Mcculloch等［2］首次從骨髓中發(fā)現(xiàn)MSCs，研究者們先后又從脂肪、臍帶、牙髓等組織中發(fā)現(xiàn)MSCs。目前MSCs已經(jīng)應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷［3］、糖尿?。?］、心臟疾?。?］和衰老虛弱［6］等多種疾病的治療研究。經(jīng)血中含有出血時(shí)脫落的子宮內(nèi)膜碎片，子宮內(nèi)膜在女性身體中每月更新，表明其中具有高度增殖能力的干細(xì)胞。Meng等［7］首次從女性經(jīng)血中分離得到子宮內(nèi)膜來(lái)源的MSCs，即經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞（MenSCs）。其具有來(lái)源廣，取材易，無(wú)創(chuàng)獲得的優(yōu)點(diǎn)，且來(lái)源于人體廢棄物，避免倫理問(wèn)題。作者對(duì)MenSCs形態(tài)、增殖、鑒定和體外分化進(jìn)行研究，從而解決再生醫(yī)學(xué)和組織工程的理論和臨床應(yīng)用中的種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）經(jīng)血來(lái)源：選擇20～30歲健康女性志愿者，其月經(jīng)規(guī)律，月經(jīng)量正常，臨床檢查無(wú)生殖器畸形和內(nèi)分泌疾病。志愿者于月經(jīng)第2天用月經(jīng)杯收集經(jīng)血5ml。（2）主要試劑：1.073g/L Ficoll分離液購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；DMEM/12培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；抗人CD73 PE、CD90 PITC、CD105 PE、CD19 APC、CD45 PITC、CD34 PE、CD14 APC抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2019年11月至2020年4月。

1.2 方法 （1）細(xì)胞分離培養(yǎng)：將收集的經(jīng)血與等體積PBS（含1%青霉素-鏈霉素）混合，4℃保存，在24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。用Ficoll密度梯度離心法分離MenSCs，將經(jīng)血樣本吹打混勻，置于等體積Ficoll分離液上層，1800r/min離心25min，取離心后的中間細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，再用含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2濃度、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁集落形成記為P0，細(xì)胞密度達(dá)90%，消化傳代。（2）繪制生長(zhǎng)曲線：取生長(zhǎng)良好的MenSCs，消化離心后將細(xì)胞重懸成密度為2×107個(gè)/L單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種100μl，置于37℃、5% CO2濃度、飽和濕度下培養(yǎng)。在1、3、5、7、9d的固定時(shí)間向各孔中加入10μl CCK-8溶液孵育4h后，測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度。（3）細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)：取生長(zhǎng)良好的MenSCs用0.25%胰酶消化，PBS漂洗2遍，再用PBS制成1×106個(gè)/L單細(xì)胞懸液，在待測(cè)樣本中各加入CD73 PE、CD90 PITC、CD105 PE、CD19 APC、CD45 PITC、CD34 PE和CD14 APC抗體1μl，同時(shí)以PBS作為空白對(duì)照。避光室溫孵育30min，PBS洗2遍，1300r/min離心5min，用PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（4）成脂誘導(dǎo)分化：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行。收集生長(zhǎng)良好的第三代MenSCs進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)分化，接種MenSCs（4×104個(gè)/孔）于12孔板中培養(yǎng)6h后，更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，換液1次/3～4d，連續(xù)培養(yǎng)14d，用4%多聚甲醛固定，再加入油紅O染色。

2 結(jié)果

2.1 MenSCs的形態(tài)特征 原代分離的細(xì)胞24h后可觀察到少量不規(guī)則形、多邊形或多角形貼壁細(xì)胞，72h后全量換液，棄去雜質(zhì)細(xì)胞。12～14d后原代細(xì)胞（P0）貼壁成單層，傳代后為P1代細(xì)胞（見圖1）。隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞種群逐漸同類化，多數(shù)細(xì)胞呈紡錘狀，排列呈漩渦狀且成簇，表現(xiàn)出典型的MSCs特征。

圖1 MenSCs（A：P0，B：P1）的形態(tài)特征（比例尺：100μm）

2.2 MenSCs的生長(zhǎng)曲線 經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞增殖能力（見圖2），第1～3天細(xì)胞緩慢增長(zhǎng)，為生長(zhǎng)期的潛伏期，第3 天開始細(xì)胞增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，快速增長(zhǎng)，第5 天后對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期。

圖2 MenSCs的生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞表面分子標(biāo)志物檢測(cè) 經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)鑒定表明細(xì)胞高表 達(dá)CD73、CD90和CD105，低 表 達(dá)CD14、CD34、CD45及CD19，符合MSCs表面分子標(biāo)志物表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。見圖3。

圖3 MenSCs表面分子標(biāo)志物鑒定

2.4 MenSCs成脂誘導(dǎo)分化 經(jīng)血來(lái)源干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化情況（見圖4），利用MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞，結(jié)果可見，成脂誘導(dǎo)后，鏡下可見透明圓形脂滴亮點(diǎn)，油紅O染色為陽(yáng)性。

圖4 MenSCs成脂分化實(shí)驗(yàn)

3 討論

人類的子宮內(nèi)膜在女性一生中至少要經(jīng)歷400個(gè)增殖、分化和脫落周期，是一種活力強(qiáng)盛不斷更新的組織［8］。子宮內(nèi)膜組織的厚度可在4～10d內(nèi)從0.5mm增長(zhǎng)至5～7mm，其生長(zhǎng)水平與表皮、腸上皮及造血系統(tǒng)等高度再生組織中的細(xì)胞更替速度相當(dāng)，甚至更快。在高度再生組織中，成體干細(xì)胞通過(guò)分化補(bǔ)充損失的細(xì)胞，以維持組織的穩(wěn)態(tài)［9］。以上結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜中可能存在具有高度增殖分化能力的成體干細(xì)胞。2007年Meng等［7］從女性經(jīng)血中分離得到子宮內(nèi)膜來(lái)源的MSCs，即MenSCs。目前國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)MenSCs具有非常強(qiáng)的自我更新和多向分化能力，在生殖、免疫、心血管、消化和神經(jīng)等系統(tǒng)和代謝疾病方面具有初步的研究進(jìn)展［10］。MenSCs來(lái)源于經(jīng)血，可以有規(guī)律的不斷從同一女性志愿者中獲取具有相同遺傳背景的MSCs，為MSCs的理論研究和臨床應(yīng)用提供了便利。本研究結(jié)果表明，經(jīng)血經(jīng)Ficoll密度梯度離心法可以分離得到大量的貼壁生長(zhǎng)的紡錘狀細(xì)胞。生長(zhǎng)曲線顯示，在經(jīng)歷3d短暫的潛伏期后，其可以迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明細(xì)胞活力強(qiáng)。對(duì)分離得到的細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果表明，CD73、CD90和CD105為陽(yáng)性表面標(biāo)志物，CD14、CD34、CD45和CD19為陰性表面標(biāo)記物，CD34、CD45表達(dá)陰性表明其為非造血性細(xì)胞，與Meng等［7］對(duì)MenSCs表面分子標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果一致，符合MSCs表面分子標(biāo)志物表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。多向分化潛能也是判斷MSCs的條件之一，體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明本研究分離得到的細(xì)胞可向脂肪細(xì)胞分化。以上結(jié)果符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出的MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)［11］，可以判定本研究分離得到的貼壁生長(zhǎng)的紡錘狀細(xì)胞是MenSCs。

綜上所述，MenSCs可以從健康女性經(jīng)血中分離得到，其具有MSCs常規(guī)的細(xì)胞表面標(biāo)志物和相應(yīng)的生物學(xué)特性，表明本研究初步成功地建立一種簡(jiǎn)單可行的MenSCs分離培養(yǎng)方法。MenSCs具有來(lái)源廣泛、取材方便、無(wú)創(chuàng)取材、無(wú)倫理道德問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，且增殖迅速，具有多向分化潛能，證明其是開展再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究更理想的種子細(xì)胞。本研究為下一步利用MenSCs進(jìn)行人類組織工程學(xué)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。