超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮β-葡聚糖的工藝優(yōu)化

李密轉(zhuǎn)， 路文秀， 李名立， 李秋萍

(遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 遵義 563003)

燕麥?zhǔn)鞘澜绺鞯貜V泛種植的禾本科燕麥屬草本植物，有皮燕麥和裸燕麥2種品種。我國是世界燕麥主產(chǎn)國之一，以裸燕麥為主，燕麥種植面積在70萬hm2左右，每年產(chǎn)量平均約85萬t，呈逐年上升趨勢[1]。燕麥主要用作飼料，雖然其產(chǎn)量呈逐年增加趨勢，但在食品行業(yè)中的應(yīng)用較少。世界大約73%的燕麥作為家畜的飼料和飼草，12%的燕麥加工成營養(yǎng)食品，15%的燕麥作為種子和其他工業(yè)用途[2]。其中12%的燕麥加工產(chǎn)品隨著燕麥資源的深入開發(fā)呈現(xiàn)多樣化，其產(chǎn)品包括燕麥米、燕麥粉、燕麥片、燕麥飲料、燕麥醋、燕麥啤酒、燕麥多肽、燕麥蛋白粉、燕麥方便面和燕麥面包等[3]。

β-葡聚糖是谷物胚乳和糊粉層細(xì)胞壁的一種水溶性膳食纖維，是由D-葡萄糖以連續(xù)的β-(1→4)糖苷鍵和單個的β-(1→3)糖苷鍵連接而成的線性多糖[4]，具有降低膽固醇、降低血糖、調(diào)節(jié)免疫、降低腸癌風(fēng)險等特殊生理功能的營養(yǎng)成分[5-7]，其主要存在于大麥和燕麥中，燕麥中β-葡聚糖主要存在于燕麥外層部分，即燕麥加工的副產(chǎn)品——燕麥麩[8]。燕麥麩中β-葡聚糖含量為5%～13%，略高于其他谷物中β-葡聚糖的含量，從燕麥麩中提取β-葡聚糖，一方面可提高燕麥資源的利用率，另一方面可獲得具有特殊生理功能的高含量的β-葡聚糖。以燕麥麩為原料提取β-葡聚糖可實現(xiàn)燕麥資源的高值化利用，帶動其他產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提高經(jīng)濟效益[9-11]。因此，開展燕麥麩皮中β-葡聚糖的提取研究具有十分重要的意義。

目前，β-葡聚糖的提取方法有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法包括超聲提取法、微波提取法、超高壓提取法等?；瘜W(xué)法包括溶劑提取法、堿提法、酸提法等。生物法主要為酶法提取。這些方法因只采用1種方式或方法來提取，其提取率較低。隨著聯(lián)合提取技術(shù)的發(fā)展，物理與物理、物理與化學(xué)、物理與生物等提取方法相結(jié)合的方式越來越受到人們的關(guān)注。即采用溶劑與超聲輔助提取、溶劑與微波輔助提取、堿與超高壓輔助提取等聯(lián)合的提取方式可克服傳統(tǒng)提取方法提取率低、耗時長等缺點，從實現(xiàn)聯(lián)合協(xié)同作用的角度提高待分離產(chǎn)物的提取率。王沖[12]等采用超高壓與超聲波結(jié)合的方式提取藜麥中β-葡聚糖，相比于單獨提取，超聲法提取率為1.16%，超高壓法提取率為1.34%，超高壓聯(lián)合超聲波提取法其提取率可高達到1.66%。聯(lián)合提取具有提取率高、節(jié)省時間、節(jié)約能源等特點。單一的超聲提取法是利用空化效應(yīng)分離物質(zhì)的物理法[13-15]，單一的酶提法是利用酶的特異性使雜質(zhì)分解去除的生物法。而研究超聲與酶法結(jié)合的提取法較少，采用超聲聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮中的β-葡聚糖能夠從空化效應(yīng)和酶解協(xié)同作用2個方面，實現(xiàn)β-葡聚糖的高效提取。因此，采用超聲波聯(lián)合生物酶法提取燕麥麩皮中的β-葡聚糖，通過單因素及正交試驗探究超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮中β-葡聚糖的最佳提取工藝，以提高β-葡聚糖的提取率，以期為燕麥資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

燕麥麩皮：甘肅省白銀市會寧縣大溝鎮(zhèn)生產(chǎn)；耐熱α-淀粉酶、剛果紅溶液、β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：(≥95%，HPLC級，sigma公司)；95%乙醇、濃鹽酸、磷酸鈉緩沖液等均為分析純。

儀器設(shè)備： FA2004N型電子天平，上海德興儀器有限責(zé)任公司；B220型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器生產(chǎn)廠；759S紫外分光光度計，上海德興科技儀器有限責(zé)任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海上登實驗設(shè)備有限責(zé)任公司；PHS-3C型pH計，上海大普儀器有限公司；JP-100S型超聲波機，深圳市潔盟設(shè)備有限公司；燒杯、量筒、容量瓶、錐形瓶、移液管等。

1.2 方法

1.2.1 超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮β-葡聚糖 提取工藝流程：燕麥麩→粉碎過篩→水溶加熱處理→超聲波提取→離心分離→上清液→淀粉酶水解除淀粉→滅酶→去除蛋白質(zhì)→離心分離→沉淀→干燥→β-葡聚糖操作要點：秤取10～12 g燕麥麩皮，過0.5 mm篩，按比例添加蒸餾水，混勻，經(jīng)過水浴一定溫度和時間加熱后，經(jīng)一定條件的超聲處理，6 000 r/min離心20min后取上清液，采用高溫耐熱的α-淀粉酶水解淀粉，將溶液水溶加熱溫度調(diào)至95℃，pH調(diào)至6.5，加熱30 min后水解去除提取液中的淀粉，之后選取高溫滅酶法去除淀粉酶。在快速攪拌條件下，將溶液的pH通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%鹽酸緩慢調(diào)節(jié)至4.5，6 000 r/min離心20 min通過等電沉淀法去除燕麥麩皮中的蛋白質(zhì)，然后6 000 r/min離心20 min離心取上清液，加95%乙醇醇沉，在4℃溫度下靜止過夜12 h后，收集沉淀，冷凍干燥后得β-葡聚糖粗品。

1.2.2β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.010 gβ-葡聚糖，加少量的去離子水，70℃水浴助溶，冷卻至室溫后定容至10 mL。冰箱貯存?zhèn)溆?，使用前稀?0倍配成0.1 mg/mL的溶液。

剛果紅溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.020 g剛果紅溶解于0.1 mol/L、pH 8.0的磷酸緩沖液中，定容至200 mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取6組10 mL的比色管，除0號為1支外，其余均為3支平行管。每組分別加入0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mLβ-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后，用去離子水補足至2.0 mL，再在以上各試管中分別加入4.0 mL剛果紅溶液，搖勻使其在一定條件下充分反應(yīng)后測定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度與β-葡聚糖含量的相關(guān)性方程為y=0.003 3x+0.020 8，相關(guān)系數(shù)為0.995 7，表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。

1.2.3β-葡聚糖含量測定及得率計算 剛果紅法測定β-葡聚糖具有操作簡單、容易等特點[16-17]，故選擇剛果紅分光光度法測定β-葡聚糖。將凍干的β-葡聚糖復(fù)溶于50 mL蒸餾水中，取5 mLβ-葡聚糖水溶液，定容于50 mL容量瓶中，量取樣液1 mL，用蒸餾水稀釋10倍，量取上述稀釋樣液0.2 mL，加蒸餾水1 mL，加入剛果紅溶液2.0 mL，20℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，以蒸餾水作空白對照，在545 nm的可見光波長的條件下，測定樣品的吸光度值A(chǔ)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣液中β-葡聚糖含量，并計算β-葡聚糖的提取率。

β-葡聚糖的提取率=(m/M)×100%

式中，m為測定的燕麥麩皮中β-葡聚糖的質(zhì)量(g)；M為燕麥麩皮質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素試驗 分別在不同料液比(g∶mL,下同)、溫度、加熱時間、超聲波功率、超聲波溫度、超聲時間、耐熱ɑ-淀粉酶添加量和酶解時間的條件下提取燕麥麩皮中的β-葡聚糖，并檢測其提取率，研究不同因素對β-葡聚糖提取率的影響。

1) 料液比。在料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶的添加量1.5%、酶解時間30 min、超聲功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間30 min的條件下，進行提取。

2) 水溶溫度。分別在水溶溫度60℃、65℃、70℃、75℃和80℃，料液比1∶10、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、酶解時間30 min、超聲功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間30 min的條件下進行提取。

3) 水溶加熱時間。分別在水溶加熱時間1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、酶解時間30 min、超聲功率為400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間30 min的條件下進行提取。

4) 耐熱α-淀粉酶添加量。分別在耐熱α-淀粉酶添加量0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、酶解時間30 min、超聲功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間30 min的條件下進行提取。

5) 耐熱α-淀粉酶酶解時間。分別在耐熱α-淀粉酶酶解時間10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、超聲功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間30 min的條件下進行提取。

6) 超聲功率。分別在超聲功率100 W、200 W、300 W、400 W和500 W，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、淀粉酶酶解時間30 min、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30 min的條件下進行提取。

7) 超聲溫度。分別在超聲溫度40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、淀粉酶酶解時間30 min、超聲功率400 W、超聲提取時間30 min的條件下進行提取。

8) 超聲時間。分別在超聲時間20 min、25 min、30 min、35 min和40 min，料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶添加量1.5%、淀粉酶酶解時間30 min、超聲功率400 W、超聲提取溫度50℃的條件下進行提取。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇4個影響較大的因素并各取3個水平，采用L9(34)正交試驗對β-葡聚糖的提取工藝進行優(yōu)化，其因素與水平見表1。

表1 超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮β-葡聚糖的正交試驗因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對燕麥麩皮β-葡聚糖提取率的影響

從圖1可知，不同料液比、水溶溫度、水溶加熱時間、耐熱ɑ-淀粉酶添加量、酶解時間、超聲功率、超聲溫度和超聲時間下燕麥麩皮β-葡聚糖提取率的變化。

2.1.1 料液比 隨著料液比的增加，β-葡聚糖的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶10時，提取率最高，之后隨著溶劑的增加提取率降低，這是由于β-葡聚糖溶出并溶解于水的溶解度是一定的，提取率達到最大值。而進一步提高料液比，會導(dǎo)致多糖分子的析出。因此料液比為1∶10時較好。

2.1.2 水溶溫度 隨著水溶溫度的升高，β-葡聚糖的提取率逐漸增加，當(dāng)溫度達75℃時，提取率最高，之后隨著溫度的升高提取率降低，這可能是由于水溶液的溫度升高，導(dǎo)致分子粘度減小，提取率降低。在一定的溫度范圍內(nèi)分子運動加快，β-葡聚糖溶出完全，因此溫度以75℃為宜。

2.1.3 水溶加熱時間 隨著加熱時間的延長，β-葡聚糖的提取率逐漸增加，當(dāng)加熱時間為4 h時，提取率最高，之后隨時間的延長提取率降低。這是由于β-葡聚糖溶出并溶解于水中需要一定的時間，而當(dāng)物料中的β-葡聚糖和水中β-葡聚糖含量達到該條件下的平衡狀態(tài)后，提取率達最大值，進一步延長水提時間會導(dǎo)致多糖分子的降解，從而使β-葡聚糖提取率降低[18]。因此選擇水溶加熱時間4 h為宜。

2.1.4 耐熱α-淀粉酶添加量 隨著淀粉酶添加量的增加，β-葡聚糖的提取率逐漸增大，當(dāng)?shù)矸勖柑砑恿繛?.5%時提取率最高，之后隨著淀粉酶添加量的增加提取率降低，這是由于在一定濃度時，酶促反應(yīng)達到反應(yīng)平衡，酶催化的效率最高，提取率最大，之后酶逐漸失活，催化效率逐漸降低，提取率降低。因此淀粉酶添加量以1.5%為宜。

2.1.5 酶解時間 隨著淀粉酶酶解時間的延長，β-葡聚糖的提取率逐漸提高，當(dāng)?shù)降矸勖该附鈺r間為30 min時，提取率最高，之后隨酶解時間的延長提取率降低，這是因為當(dāng)酶量一定時，酶解時間越長，酶解越充分，α-淀粉酶逐漸失活。因此，在提取過程中淀粉酶酶解時間以30 min為宜。

2.1.6 超聲功率 隨著超聲功率的升高，β-葡聚糖的提取率逐漸升高，這是由于超聲功率較小時，超聲波的空化作用隨著功率的加大而增強，有利于原料組織破碎。超聲功率的增加加速了溶液的水循環(huán)，使得β-葡聚糖更容易溶出和擴散到溶液中。當(dāng)超聲功率為400 W時，提取率最高。之后隨著功率的增加提取率又逐漸降低，這是由于當(dāng)超聲波功率過大時，燕麥麩皮中的非糖類雜質(zhì)溶出和β-葡聚糖的降解程度變大，使其得率降低[19]。因此在提取過程中超聲功率以400 W為宜。

2.1.7 超聲溫度 隨著超聲溫度的升高，β-葡聚糖的提取率逐漸升高，當(dāng)超聲波提取溫度為50℃，提取率最高，之后隨著溫度升高提取率降低，這可能是由于溫度升高后β-葡聚糖的降解程度加大，導(dǎo)致β-葡聚糖得率下降，因此在提取過程中選擇超聲波溫度為50℃最為適宜。

2.1.8 超聲時間 隨著超聲時間的延長，β-葡聚糖的提取率逐漸升高，當(dāng)超聲波時間為30 min時，提取率最高，之后隨著超聲時間的延長提取率降低，這是因為在一定的超聲時間內(nèi)，超聲時間的延長使溶液的振動時間延長，有利于β-葡聚糖的溶出。但超聲時間過長會增大超聲波作用強度，使β-葡聚糖的降解程度加大，導(dǎo)致β-葡聚糖得率下降[20]。因此在提取過程中超聲時間以30 min為適宜。

2.2 β-葡聚糖最佳提取工藝條件的確定

從表2可知，不同因素對燕麥麩皮β-葡聚糖提取率的影響依次為水溶溫度(B)>淀粉酶添加量(C)>超聲提取時間(D)>料液比(A)。由極差的直觀分析得到最優(yōu)的工藝條件為A1B2C2D2，即料液比為1∶10、水溶溫度75℃、淀粉酶添加量1.5%、超聲時間為30 min，在該條件下燕麥麩皮中β-葡聚糖的提取率為5.09%。

表2 超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩皮β-葡聚糖的正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，超聲波聯(lián)合酶法提取燕麥麩β-葡聚糖的最佳工藝條件為料液比1∶10、水溶加熱溫度75℃、水溶加熱時間4 h、耐熱α-淀粉酶含量1.5%、淀粉酶酶解時間30 min、超聲溫度50℃、超聲功率400 W、超聲波時間30 min，在該工藝條件下，β-葡聚糖的提取率為5.09%。