超高壓對大鯢黏液中水解酶活性與粘性的影響

董夢堯, 陳德經(jīng), 裴金金, 曾允灝, 雷 嬌

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001； 2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723001)

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科。大鯢皮膚腺體主要有粘液腺(mucus gland)和顆粒腺(granular gland)2種[1],粘液腺分泌出清澈黏液，覆蓋在身體表面形成一層濕潤的薄膜，具有防御、繁殖、保濕、皮膚呼吸、溫度調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)等作用[2-3]；顆粒腺又叫毒腺，在皮膚局部聚集形成特殊的腺體結(jié)構(gòu)，能夠分泌抗菌肽和藥理活性肽等生物活性物質(zhì)[4-5]。大鯢黏液中有許多活性成分，其中糖蛋白中總糖含量為4.23%，蛋白質(zhì)含量為61.86%[6]。徐偉良等[1]通過鄰苯三酚自氧化法、DPPH法以及小鼠灌胃毒性檢測到大鯢黏液具有抗氧化性和低毒性，脫毒后可開發(fā)為保健品。大鯢黏液由于具有粘性和抗氧化性，可以用于制造醫(yī)藥粘合劑；以粘蛋白生產(chǎn)的天然粘合劑具有良好的生物相容性，可開發(fā)為生物粘合劑[7]。水產(chǎn)動物、植物中存在大量水解酶。朱蓓薇等[8]采用硫酸銨分級鹽析、Sephadex-100分子篩柱層析方法對海參自溶酶進(jìn)行分離純化發(fā)現(xiàn)，純化的酶為酸性蛋白酶，對熱不穩(wěn)定且不同的金屬離子(如Mn2+、Zn2+)對酶的活性有抑制或激活作用。曾紹橋等[9]采用超高壓處理海參發(fā)現(xiàn)，海參自溶酶的蛋白酶活力隨壓力的增加而下降，當(dāng)壓力大于200 MPa時蛋白酶活力被顯著抑制。大鯢黏液作為生物粘合劑材料，采集后很快水解而粘性降低。為保持大鯢黏液的粘性，采用超高壓使酶失活并實現(xiàn)冷殺菌,研究其對黏液粘性的影響，以期為大鯢黏液生物粘合劑的制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鯢黏液采自實驗室自養(yǎng)大鯢。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、氯化鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、酪蛋白及Folin-酚試劑均購于合肥博美生物科技有限公司；蛋白Mark(PM2510)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸、巰基乙醇及甘油均購置于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鯢黏液溶解液篩選 刮取新鮮大鯢黏液，按黏液∶溶劑=1∶5的比例于20℃條件下溶解于水、乙酸、氫氧化鈉及抗壞血酸(Vc)中5 h，采用磁力攪拌器、超聲波、38℃水浴鍋恒溫加熱等方法輔助溶解，記錄大鯢黏液的溶解情況，根據(jù)溶解前后黏液干重的比例計算溶解度。

1.2.2 大鯢黏液粘度及變化測定 取大鯢鮮黏液、凍干黏液粉末各1.00 g，采用磁力攪拌器輔助加快溶解，將大鯢黏液溶解于1.2.1選出的最佳溶解液中，SNB-2粘度計測量黏液的粘性。根據(jù)新鮮黏液的粘度大小選擇最佳溶解液，測定1.00 g新鮮黏液在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h及5 h的粘度和在每個時刻析出的水分占所刮取的黏液的體積比。

1.2.3 水解酶活力的測定

1) 大鯢黏液中水解酶的制備。參照朱蓓薇等[8]自溶酶的測定方法。取大鯢鮮黏液、凍干黏液粉末各10.00 g，按1∶4(大鯢黏液質(zhì)量比/磷酸鹽緩沖液體積)加入0.10 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.3)，浸提，4℃靜置過夜存放備用。

2) 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸曲線的建立。準(zhǔn)確稱取L-酪氨酸100.00 mg于105℃的烘箱中烘干3 h，溶于60.00 mL 0.10 mol/L HCl溶液中，再用去離子水準(zhǔn)確定容至1 L容量瓶中，得酪氨酸溶液100.00 μg/L，并依次稀釋為10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、30.00 μg/mL、40.00 μg/mL、50.00 μg/mL、70.00 μg/mL、80.00 μg/mL的酪氨酸溶液。移取各濃度溶液1.00 mL于一系列試管中，在40℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min，各取1.0%酪蛋白溶液2.00 mL加入試管中，保溫10 min，立即加入2.00 mL 5%三氯乙酸溶液，使蛋白變性，終止反應(yīng)，4 000 r/min離心8 min。取1.00 mL上清液于試管中，依次加入0.55 mol/L Na2CO3溶液5.00 mL和 Folin-酚試劑0.50 mL，搖勻，顯色15 min。在650 nm下，用722分光光度計測定吸光度(OD值)。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算K值。

3) 水解酶活力的測定。吸取1.00 mL配制好的大鯢鮮黏液和凍干黏液的粗酶液，稱重(m)，加入9.00 mL的蒸餾水，稀釋10倍。吸取1.00 mL稀釋酶液到試管中。按照測定酪氨酸濃度的方法測定大鯢鮮黏液與凍干粉中的酪氨酸濃度，3次重復(fù)，取平均值，計算酶活力。

X=(◎×5×n)/10m

式中，X為酶活力，◎為根據(jù)測定的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的酪蛋白的微克數(shù)；5為反應(yīng)的總體積；10為反應(yīng)時間10min；n為酶稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 酶分子量測定 參照林方養(yǎng)等[10-11]的方法測定，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，選取12%分離膠，5%濃縮膠，蛋白Marker為PM2510，分子量為10～180 kDa。

1.2.5 影響水解酶活性及黏液粘性的因素測定

1) 壓力。準(zhǔn)確稱取1.00 g大鯢新鮮黏液6份，分別放入真空袋抽真空后放入0.10 MPa、100 MPa、200 MPa、300 MPa、400 MPa、500 MPa下保壓30 min，取出后溶解于pH 6.3的磷酸鹽緩沖液， 4℃下磁力攪拌輔助提取，測酶活力和黏液粘性。

2) 溫度。取5組1.00 g的大鯢黏液，分別置于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃水浴30 min，取2等份黏液，1份溶于磷酸鹽緩沖液測定水解酶活性，另一份測定黏液粘性。

1.2.6 超高壓對大鯢黏液的抑菌測定 分別取1.00 g的大鯢黏液放入真空袋抽真空后放入100 MPa、200 MPa、300 MPa、400 MPa、500 MPa下保壓30 min，再以0.10 MPa下1.00 g黏液作為對照，參照食品微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)[12]檢測6種壓力情況下各樣品的菌落總數(shù)，判斷超高壓對大鯢黏液的抑菌效果，計算菌落致死率。

致死率=(未處理樣品的菌落總數(shù)-處理樣品后的菌落總數(shù))/未處理樣品的菌落總數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.5、Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢黏液的溶解度

由表1可知，大鯢黏液難溶于水，溶解度低，僅為5.06 mol/L；易溶于乙酸、Vc及氫氧化鈉溶液，以在0.75 mol/L 乙酸溶液和0.75 mol/L Vc溶液中的溶解度最高。乙酸和氫氧化鈉有一定的酸度和堿度，對人體皮膚有一定的損害作用，Vc為弱酸溶液，有一定的抗氧化作用，在人體氧化代謝中可促進(jìn)膠原及結(jié)締組織的合成、促進(jìn)傷口愈合，清除自由基。故制造生物粘合劑時宜選擇0.75 mol/L Vc為溶解液。

2.2 大鯢黏液粘度

從表2看出，大鯢黏液在乙酸溶液和Vc溶液中的粘性和流出時間相差不大。從圖1看出，以Vc作溶解液，在常溫下隨著大鯢黏液放置時間的增加，水解液所占黏液總重的百分比不斷增大，黏液粘度不斷減小，說明水解液的流出對于粘性有一定的影響。

2.3 大鯢黏液水解酶的活性

繪制的酪氨酸酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.004 4X+0.437 4。由圖2可知，水解酶活性新鮮黏液中的(95.23 U/mg)高于凍干后的(82.50 U/mg)，表明凍干的大鯢黏液能夠很好地保持其酶活性，且不具有明顯的抑制作用。

2.4 水解酶的蛋白分子量

從圖3看出，對比標(biāo)品Mark分子量，可知大鯢黏液水解酶粗提液中的水解酶的分子量區(qū)間有30 kDa、36 kDa、43 kDa、140 kDa和180 kDa。根據(jù)條帶亮度可知，分子量在25～35 kDa、140～180 kDa的蛋白水解酶含量較多，為主要水解酶。

表1 大鯢黏液在不同溶劑中的溶解度

表2 大鯢黏液溶解液的粘性

2.5 超高壓和溫度對大鯢黏液水解酶活性及粘性的影響

2.5.1 壓力 從圖4看出，隨著壓力的增加，酶活降低。原因是壓力破壞黏液中水解酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶失活，壓力越高，酶活越低，當(dāng)壓力處于200 MPa時酶活已經(jīng)趨近于0。因保壓30 min時酶活性基本缺失，因此不需再作保壓時間影響探究。大鯢黏液粘性隨著壓力的增加而降低，在200 MPa之后基本趨于穩(wěn)定。與常壓下新鮮黏液相比，粘性降低1.67%，但對于大鯢黏液粘性起到了很好的穩(wěn)定效果。說明，壓力能夠有效地抑制酶活力，大鯢黏液粘性變化不大。

2.5.2 溫度 從圖5看出，大鯢黏液水解酶的活力和粘度均隨著溫度的升高面下降。在25～35℃時大鯢黏液水解酶的活力較高，是因為此溫度區(qū)間是酶的最適溫度；25℃時，大鯢黏液水解酶的活力即為最大值，隨著溫度升高，酶的活力逐漸降低，且在60℃時酶基本失活。故最適水解酶生存溫度為25℃。而60℃下菌落無法完全滅活，因此不對幾種溫度下大鯢黏液中菌落總數(shù)進(jìn)行探討。60℃后大鯢黏液水解酶的粘度下降46.44%。

2.6 超高壓對大鯢黏液抑菌活性的影響

從圖6看出，高壓處理后大鯢黏液中菌落總數(shù)較未處理的明顯降低，且菌落總數(shù)隨著壓力的升高而減小， 500 MPa下致死率達(dá)98.5%。說明，超高壓能極好地抑制大鯢黏液中菌落的生長。

3 結(jié)論與討論

研究表明，大鯢黏液易溶解于Vc溶液與乙酸溶液，在Vc溶液與乙酸溶液濃度均為0.75 mol/L時，溶解度分別為99.4%和98.4%。在制作生物粘合劑時，因為乙酸和堿性溶解對人體皮膚有刺激作用，而選用有抗氧化、清除自由基作用的Vc溶液作為最佳溶解液。超高壓處理的理論基礎(chǔ)主要為Pascal原理和Lechatelier原理，在處理食品時，分子構(gòu)象改變和化學(xué)反應(yīng)平衡等都會向著體積減少的方向發(fā)展，超高壓處理時通過對菌體蛋白種的非共價鍵進(jìn)行破壞，如離子鍵、二硫鍵等，破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)而使酶失活，蛋白質(zhì)凝固，能使菌體內(nèi)的化學(xué)組出現(xiàn)外流等多種細(xì)胞損傷，造成菌體細(xì)胞膜破裂，還能對DNA等遺傳物質(zhì)的復(fù)制形成影響，從而殺死微生物[13]。壓力也會改變介質(zhì)的pH，縮小微生物的生長空間[14]，較大壓力下也會殺滅大腸桿菌。超高壓技術(shù)近幾年來廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及水產(chǎn)品的加工、保藏、冷凍等，能夠充分保存產(chǎn)品營養(yǎng)成分，抑制菌體微生物生長[15]。大鯢黏液中存在活性較高的水解酶，鮮黏液的酶活性比凍干后的酶活性略高，利用超高壓技術(shù)處理大鯢新鮮黏液，能抑制水解酶的活性，降低水解酶水解粘性蛋白多肽鍵的能力，從而使粘性趨于穩(wěn)定，也可有效殺滅微生物，保持黏液的衛(wèi)生。

利用超高壓處理大鯢黏液可有效抑制黏液中水解酶活性，保持粘性且抑菌性好，將經(jīng)高壓處理后的大鯢黏液溶于Vc能得到粘性極好的溶解液，可用于生產(chǎn)粘性極好、儲藏不受影響的生物類醫(yī)藥粘合劑、粘合膜，為生物粘合劑的開發(fā)提供依據(jù)與借鑒，推動大鯢黏液的高值化加工利用。