大麻哈魚生長前期生殖相關內(nèi)分泌激素水平及性腺組織學觀察

李培倫， 王繼隆， 魯萬橋， 唐富江， 劉 偉

(中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所， 黑龍江 哈爾濱 150070)

魚類性腺發(fā)育主要包括原始生殖細胞的發(fā)生、遷移、分化及配子形成等過程，性腺在發(fā)育成熟過程中受基因表達、魚體年齡、外界環(huán)境條件、餌料狀況等因素的影響[1-2]。魚類生殖內(nèi)分泌調(diào)控由下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)控制，故HPG軸在魚類性腺發(fā)育過程中起主導調(diào)控作用[3-4]。魚類生殖相關內(nèi)分泌激素主要包含促性腺激素釋放激素(GnRH)[如垂體激素促黃體生長激素(LH)、促卵泡素(FSH)]及性類固醇激素[如睪酮(T)、雌二醇(E2)]。DOROSHOV等[5]指出，下丘腦分泌GnRH調(diào)節(jié)垂體合成并釋放FSH和LH，而FSH和LH調(diào)節(jié)性腺生成的T和E2不僅可促進性腺的發(fā)育成熟，還能通過負反饋作用抑制GnRH的合成。性腺發(fā)育是硬骨魚類繁殖行為的重要體現(xiàn)，亦是魚體與外界環(huán)境相協(xié)調(diào)的表現(xiàn)，通過研究性腺的生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)及其調(diào)控因素，可以探討其不同時期的繁殖特性，進而在養(yǎng)殖過程中對其生殖生理過程進行適當調(diào)控。

大麻哈魚(Oncorhynchusketa)屬鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、大麻哈魚屬(Oncorhynchus)，俗稱大馬哈魚、大馬哈、秋鮭等，廣泛分布于北冰洋、北太平洋及其有出?？诘牡恿髦?，國內(nèi)分布于黑龍江、圖們江和綏芬河水系[6]。大麻哈魚在江河中出生、海洋中生長發(fā)育，性成熟群體返回其出生的淡水河流進行產(chǎn)卵繁殖，為典型的溯河洄游型魚類，一生僅繁殖1次，繁殖后親體死亡[7]。近年來，由于人工捕撈強度過大、棲息地環(huán)境污染及產(chǎn)卵場所功能退化等因素，導致大麻哈魚資源儲量嚴重下降，故世界各國對其開展增殖放流以恢復種群資源，并從氣候變遷、生化遺傳及棲息地生境特征等方面展開相關研究[8-11]。目前，大麻哈魚規(guī)?；Ｋ斯ぴ鲳B(yǎng)殖技術探索處于起步階段，工廠規(guī)?；ＫB(yǎng)殖效果不佳，3齡魚出現(xiàn)腹水、食欲下降等狀況導致生長緩慢或死亡，有關養(yǎng)殖方面的報道僅在前期生長[12]、鹽度脅迫[13-14]等方面，而血清中與生殖相關的內(nèi)分泌激素水平及性腺發(fā)育方面未見報道。因此，通過測定大麻哈魚前期生長過程中血清生殖相關內(nèi)分泌激素水平，觀察其性腺發(fā)育特征，深入了解大麻哈魚養(yǎng)殖過程中性腺發(fā)育的生理學過程及生殖內(nèi)分泌調(diào)控機制，以期為其繁殖生物學研究及人工養(yǎng)殖技術提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2齡、3齡大麻哈魚各42尾，生長狀況良好，于2016年10月采集于山東煙臺東方海洋股份有限公司。試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 MS-222麻醉劑麻醉魚體，測量其叉長(F，精確至0.1 cm)、體重(BW，精確至0.1 g)等生物學指標；尾靜脈采血3～5 mL裝至離血管，室溫條件下冷卻1 h，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清，-20℃冰箱保存。最后解剖大麻哈魚，判斷性別并觀察性腺發(fā)育狀況，稱量性腺重(GW，精確至0.01g)和凈體重(NBW)，并測算性成熟系數(shù)(GSI)，最后將性腺在波恩試液中固定24 h后保存于70%酒精中，用于組織學觀察。

1.2.2 性激素測定 采用放射免疫分析技術(RIA)測定大麻哈魚血清中生殖相關內(nèi)分泌激素，包含促性腺激素釋放激素(GnRH)、促黃體生長激素(LH)、促卵泡素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)等5種激素。測定時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 組織學觀察 性腺組織經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋、SLEE切片機切片(厚度6 μm)、常規(guī)HE染色、二甲苯透明，中性樹膠封片保存。用Carl Zeiss顯微鏡觀察組織切片，SZSS 2000顯微拍照系統(tǒng)拍照測量。卵母細胞發(fā)育分期參考龔啟祥等[15]的方法，精母細胞發(fā)育分期參考SCHULZ等[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPASS19.0對數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻哈魚樣本生物學特征

從表1看出，2齡大麻哈魚在叉長、體重、凈體重、性腺重、性成熟系數(shù)等生物學指標中雌性群體均值均大于雄性群體;3齡大麻哈魚除體重和凈體重均值為雄性大于雌性外，其余指標均為雌性大于雄性。整體上，同一生長階段的大麻哈魚雌性群體個體較雄性群體稍大。2齡和3齡大麻哈魚性腺發(fā)育狀況一般，性成熟系數(shù)均較低。

2.2 大麻哈魚生殖相關的內(nèi)分泌激素水平

2.2.1 內(nèi)分泌激素水平 從表2看出，2齡、3齡雌性大麻哈魚血清中生殖相關內(nèi)分泌激素值均高于雄性，且同性別中3齡大麻哈魚血清中生殖相關內(nèi)分泌激素值亦均高于2齡。血清生殖相關內(nèi)分泌激素含量最高的均為促卵泡素(FSH)，含量最低的均為睪酮(T)。

表1 大麻哈魚的基本生物學特征

表2 大麻哈魚血清生殖相關內(nèi)分泌激素含量

2.2.2 內(nèi)分泌生殖激素間差異性及相關性 差異顯著性分析結(jié)果(表3，表4)表明，大麻哈魚雌、雄魚間的內(nèi)分泌生殖激素除睪酮(T)具有顯著差異外，其余的差異不顯著。2、3齡間內(nèi)分泌生殖激素除睪酮(T)具有顯著差異外，其余的均為差異極顯著。不同齡大麻哈魚各種性激素水平的相關性分析結(jié)果(表5)表明， 2齡大麻哈魚中各生殖相關內(nèi)分泌激素之間相關性均極顯著。其中， LH與 FSH間相關性最強，達0.775； T與 GnRH間相關性最弱，僅0.445；說明2齡大麻哈魚個體之間生長差異不太明顯，故各種激素水平存在較強的相關性。3齡大麻哈魚除LH與各激素間相關性不顯著外，其余各激素間均具有極顯著相關性，且3齡大麻哈魚GnRH與FSH、T與E2間的相關性高于2齡，其他各激素之間的相關性均低于2齡。說明，隨著大麻哈魚年齡生長，群體中出現(xiàn)生長差異，個體間的差距變得逐漸明顯，導致其生殖相關內(nèi)分泌激素之間的相關性出現(xiàn)較大變化。

表3 大麻哈魚不同性別間血清生殖相關內(nèi)分泌激素的差異顯著性

表4 不同齡組間血清生殖相關內(nèi)分泌激素差異顯著性

表5 大麻哈魚血清生殖相關內(nèi)分泌激素間的相關系數(shù)

2.3 大麻哈魚的性腺組織解剖結(jié)構(gòu)

解剖觀察結(jié)果(圖1)顯示，2齡和3齡大麻哈魚卵巢呈淡黃色或粉白色，呈扁平狀，卵巢前端膨大、后端逐漸收縮變窄，由輸卵管連接至肛門，肉眼可見排列緊密的卵粒且卵粒不分離(圖1A,圖1D)。2齡大麻哈魚卵巢組織中主要由第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ時相卵母細胞構(gòu)成(圖1B)，其中，第Ⅰ時相卵母細胞位于卵巢膜邊緣處，形狀不規(guī)則，呈三角形、長橢圓形等，卵徑較小，長徑(191.09±23.38) μm，短徑(114.52±11.66) μm，其在卵巢組織中所占比例為30.77%；第Ⅱ時相卵母細胞數(shù)量最多，占總細胞數(shù)的46.16%，呈長橢圓形，其中長徑(397.74±73.93) μm、短徑(304.69±66.06) μm；第Ⅲ時相卵母細胞數(shù)量最少，占23.08%，細胞呈圓形或卵圓形，其卵徑為(514.49±97.94) μm、核徑(190.38±17.62) μm (圖1C)。3齡大麻哈魚卵巢內(nèi)主要為第Ⅲ時相卵母細胞，約占細胞總量90%以上，及少量的第Ⅰ時相卵母細胞，所占比例低于10% (圖1E)；其中第Ⅲ時相卵母細胞多呈規(guī)則的圓形，卵徑為(709.36±153.46) μm、核徑(2 373.61±28.64) μm (圖1F)。

2齡和3齡大麻哈魚精巢呈長圓柱狀、較細，外觀淡紅色，能夠憑肉眼直接與卵巢區(qū)分開(圖1G,圖1J)。2齡大麻哈魚精巢組織學觀察結(jié)果顯示，精巢內(nèi)精母細胞處于精原細胞期，精原細胞為圓形、染色較深(圖1H, 1I)。而3齡大麻哈魚精巢內(nèi)的精母細胞，主要由少量精原細胞期及大量的初級精母細胞組成，期中精原細胞主要位于精小葉的邊緣處(圖1K)，而初級精母細胞則聚集在精小葉內(nèi)(圖1L)。

3 結(jié)論與討論

魚類的繁殖策略是其在長期進化過程中與棲息環(huán)境條件逐步相適應的結(jié)果，諸多研究表明，垂體激素、性類固醇激素、各類生長因子等均是影響魚類性腺發(fā)育的重要因素[2-5]。目前，有關魚類不同生長時期性類固醇激素水平與性腺發(fā)育之間關系的研究報道較多，如馬蘇大麻哈魚(Oncorhynchusmasou)[17]、泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)[18]、達氏鰉(Husodauricus)[19]、大鱗鲃(Luciobarbuscapito)[20]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss[21]等，以上研究表明，魚體在不斷生長過程中其性類固醇激素分泌水平與性腺發(fā)育狀況相協(xié)調(diào)，或呈一定的季節(jié)變化、或呈年度變化。研究結(jié)果表明，2齡、3齡血清生殖相關內(nèi)分泌激素中含量最高的均為促卵泡素，含量最低的均為睪酮，各生殖相關內(nèi)分泌激素之間存在不同程度的相關性，而3齡大麻哈魚促性腺激素釋放激素與促卵泡素、睪酮和雌二醇之間的相關性高于2齡，推斷大麻哈魚在不斷生長發(fā)育的同時，促性腺激素釋放激素通過正向調(diào)節(jié)垂體激素生成，進一步促進性類固醇激素的釋放，以此推動性腺中卵母細胞或精母細胞的生長發(fā)育。3齡大麻哈魚血清中生殖相關內(nèi)分泌激素含量較2齡有明顯的提升，且性腺重量也相應增加，說明在大麻哈魚性成熟之前，隨著年齡增加，魚體內(nèi)部生殖相關內(nèi)分泌激素的分泌量不斷提高，與達氏鰉[19]、大鱗鲃[20]等的研究結(jié)果一致。

性腺發(fā)育是魚類繁殖的基礎，通過了解性腺組織結(jié)構(gòu)可更好地掌握魚類的繁殖習性。魚類卵巢中卵母細胞的發(fā)育方式分為非同步型、部分同步型及完全同步型[22]。研究結(jié)果顯示，2齡大麻哈魚卵巢內(nèi)含有3個時相的卵母細胞，而3齡卵巢內(nèi)90%以上為第Ⅲ時相且缺乏第Ⅱ時相卵母細胞，說明大麻哈魚在生長過程中卵巢內(nèi)卵母細胞逐步發(fā)育為完全同步型，與野生環(huán)境下大麻哈魚一次性產(chǎn)卵的特性相吻合。根據(jù)硬骨魚類精巢內(nèi)精細胞的發(fā)育和分布特點，精巢結(jié)構(gòu)可分為小葉型和小管型[23]，其中大部分魚類精巢結(jié)構(gòu)屬于小葉型，如烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[24]、烏蘇里白鮭(Siberiangudgeon)[25]、翹嘴鲌(Culteralburnus)[26]等。本研究中2齡大麻哈魚精巢組織內(nèi)精母細胞處于精原細胞期，而3齡大麻哈魚精巢內(nèi)主要由少量精原細胞期及大量的初級精母細胞組成且初級精母細胞聚集在精小葉內(nèi)，說明2齡、3齡大麻哈魚精巢組織內(nèi)生殖細胞處于精原細胞向精母細胞轉(zhuǎn)化這一早期發(fā)育階段。黑龍江水系大麻哈魚溯河洄游繁殖群體主要為4～6齡、產(chǎn)卵期為9-11月[11, 27]。目前，人工養(yǎng)殖大麻哈魚在養(yǎng)殖過程中未出現(xiàn)性成熟個體的相關報道。研究結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，性腺重量雖然在不斷增加，但性成熟系數(shù)卻減小，說明大麻哈魚在2齡、3齡生長階段，性腺生長速度低于魚體生長速度，在這一生長時期更側(cè)重于個體的生長，而3齡大麻哈魚卵巢在10月份時，其內(nèi)卵母細胞90%以上處于第Ⅲ時相，推測其已做好發(fā)育成熟的前期準備，只待魚體生長至一定程度且季節(jié)、溫度、光照等外界條件適宜，性腺可迅速發(fā)育至成熟繁育狀態(tài)。