噬菌體防治嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

成亞輝， 王子藝， 高棟業(yè)， 肖 煒， 張仕穎*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省土壤培肥與污染修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201； 2.云南大學(xué) 云南省微生物研究所， 云南 昆明 650091)

嗜水氣單胞菌是一種常見的條件致病菌，可引起兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類、魚類和其他動(dòng)物疾病，甚至感染人類[1-3]。過去幾十年，抗生素被普遍應(yīng)用于治療細(xì)菌性疾病感染，但抗生素的不合理使用會(huì)導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]。隨著抗生素的治療效果越來越不明顯，加之成本高、污染環(huán)境、抗藥性增加等一系列問題，人們不得不尋找其他可能的替代療法。噬菌體是感染和殺滅細(xì)菌的病毒，在環(huán)境中分布廣泛。噬菌體的發(fā)現(xiàn)最早可追溯到19世紀(jì)90年代，英國(guó)科學(xué)家Ernest Hanbury Hankin發(fā)現(xiàn)印度恒河兩岸爆發(fā)的霍亂疫情沒有迅速蔓延，并隨時(shí)間的推移自動(dòng)消失，研究后其認(rèn)為是人們飲用的恒河水中存在某種可以殺滅霍亂病菌的物質(zhì)。1915年Edward Twort首次報(bào)道關(guān)于噬菌體的研究，1917年D’Herelle正式提出噬菌體的概念[6-9]。早在噬菌體被發(fā)現(xiàn)初期，就被用于治療人類和動(dòng)物感染的細(xì)菌性疾病，即噬菌體治療。D’Herelle提出噬菌體可用于治療細(xì)菌感染后，在1919年用噬菌體制劑治愈4名痢疾患者，證實(shí)噬菌體治療的價(jià)值[10]。20世紀(jì)40年代，由于人們對(duì)噬菌體生物學(xué)相關(guān)知識(shí)的匱乏，加上青霉素的應(yīng)用帶來了抗生素的黃金時(shí)代，西方科學(xué)家逐漸對(duì)噬菌體治療的研究喪失興趣，但俄羅斯、格魯吉亞、波蘭等少數(shù)東歐國(guó)家卻將噬菌體治療沿用至今[6,11]。近年來，由于耐藥菌株的大量出現(xiàn)，抗生素治療效果不盡人意，而噬菌體作為一種天然有效的殺菌劑，具有較高的安全性和有效性，噬菌體治療重新被科學(xué)界重視起來[12-15]。鑒于此，從嗜水氣單胞菌的感染、嗜水氣單胞菌噬菌體和嗜水氣單胞菌噬菌體治療等方面對(duì)嗜水氣單胞菌噬菌體及其應(yīng)用研究現(xiàn)狀進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在尋找防治嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病可能的替代方案，并為噬菌體治療的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 嗜水氣單胞菌的感染

1.1 水產(chǎn)動(dòng)物感染

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種革蘭氏陰性菌[16-17]，在淡水、土壤、食品等環(huán)境中分布廣泛。由該菌引起的最常見疾病為運(yùn)動(dòng)性嗜水氣單胞菌敗血癥，可引起多種淡水魚類出血性敗血癥、眼球突出、感染性異常水腫和鰭、尾腐爛等癥狀，同時(shí)，嗜水氣單胞菌也能感染人類，引起腹瀉、敗血癥等疾病[3,18-19]。1891年，有報(bào)道稱嗜水氣單胞菌可導(dǎo)致蛙的“紅腿病”。20世紀(jì)80年代，該菌在我國(guó)引起魚病大面積傳播，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害[20]。1986年，又引發(fā)腹瀉、敗血癥、食物中毒等疾病頻發(fā)[21]。1992年，我國(guó)南方各省淡水養(yǎng)殖漁場(chǎng)爆發(fā)由該菌引起的敗血癥[20]，次年，在北京爆發(fā)了一起嗜水氣單胞菌污染飲用水引起的急性腹瀉，發(fā)病率高達(dá)65%[22]。2001年，該菌感染導(dǎo)致圣勞倫斯河25 000條鯉魚死亡。2002年，引起印度尼西亞800余t金魚死亡，直接經(jīng)濟(jì)損失近4 000萬美元。2007年和2009年，在美國(guó)明尼蘇達(dá)州和阿拉巴馬州引發(fā)鯰魚養(yǎng)殖場(chǎng)大量污染，損失鯰魚近300萬磅。2010年，韓國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)魚類因感染嗜水氣單胞菌而大量死亡的現(xiàn)象[23-24]。近幾年，泰國(guó)養(yǎng)殖的鯰魚也出現(xiàn)大量由該菌引起的出血性敗血癥，死亡率高達(dá)80%，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[25-26]。

1.2 人類感染

嗜水氣單胞菌不僅對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)破壞嚴(yán)重，對(duì)人類健康也存在巨大威脅。2001—2011年，浙江大學(xué)附屬醫(yī)院從臨床患者腸道外分離的所有氣單胞菌屬中，嗜水氣單胞菌占61.8%[27]。2009—2011年，臺(tái)灣一所醫(yī)療中心129例由氣單胞菌引起的軟組織感染患者中，77例被確定為嗜水氣單胞菌感染，占患者總數(shù)的59.7%[28]。江麗莉等[29]報(bào)道了2例由嗜水氣單胞菌導(dǎo)致的壞死性筋膜炎病例。CALLISTER等[30]對(duì)幾種蔬菜進(jìn)行了嗜水氣單胞菌分布和致病性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其為潛在的致病來源；任超杰等收集15例感染嗜水氣單胞菌病人的分泌物發(fā)現(xiàn)，由該菌引起的非腸道感染增多，且該菌具有較高的耐藥率[31]。因此，嗜水氣單胞菌不僅是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的棘手問題，而且嚴(yán)重威脅人類生命健康，尋找能夠預(yù)防和治療嗜水氣單胞菌感染的有效手段意義重大。

2 嗜水氣單胞菌噬菌體

2.1 嗜水氣單胞菌噬菌體的發(fā)現(xiàn)及其基因測(cè)序

記錄在NCBI pubmed的第1株嗜水氣單胞菌噬菌體記載于1983年CHOW等[32]發(fā)表的關(guān)于噬菌體分離和生物學(xué)特性的研究。1994年，林業(yè)杰等[33]從福建沿海地區(qū)外環(huán)境標(biāo)本中分離出25株嗜水氣單胞菌噬菌體，并對(duì)其中6株進(jìn)行鑒定，這是我國(guó)首次分離到嗜水氣單胞菌噬菌體。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，2001年，TETART等[34]完成了第1株嗜水氣單胞菌噬菌體Aeh1的全基因組測(cè)序；2012年，SHEN等[35]完成第2株嗜水氣單胞菌噬菌體CC2的全基因組測(cè)序，這也是我國(guó)首次完成此類噬菌體的基因測(cè)序。

2.2 嗜水氣單胞菌噬菌體全基因組序列現(xiàn)狀

截止2020年4月1日，GenBank共收錄44株嗜水氣單胞菌噬菌體的全基因組序列(表1)。這些噬菌體大多從水環(huán)境中分離得到，主要來自中國(guó)、韓國(guó)、波蘭、俄羅斯、美國(guó)、澳大利亞和印度7個(gè)國(guó)家。其中，有23株屬于肌尾噬菌體科(Myoviridae)，占52.3%；12株屬于短尾噬菌體科(Podoviridae)，占27.3%；6株屬于長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)，占13.6%；另有Ahp2屬于絲狀噬菌體科(Inoviridae)，62AhydR11PP和嗜水氣單胞菌噬菌體44572基因組則尚未確定分類地位。已報(bào)道的嗜水氣單胞菌噬菌體基因組大小差異顯著，其中肌尾噬菌體科具有較大的基因組，為45～262 kb，且大于200 kb的居多；短尾噬菌體科為30～97 kb，多數(shù)為42 kb；長(zhǎng)尾噬菌體科基因組大小為45～115 kb；絲狀噬菌體科的Ahp2為47 kb；未分類的62AhydR11PP和 44572基因組大小分別為43 kb和102 kb。從核酸結(jié)構(gòu)看， 44株嗜水氣單胞菌噬菌體中，只有pAh6-C、2L372X、MJG、LAh6和44572為環(huán)狀DNA，其余39株均為線狀DNA。

表1 GenBank中可用的嗜水氣單胞菌噬菌體(截止2020年4月1日)

3 嗜水氣單胞菌噬菌體治療的研究現(xiàn)狀

3.1 單一噬菌體治療

由于噬菌體具有較高的宿主特異性和敏感性，不會(huì)對(duì)正常微生物菌群造成影響[36]，因此，噬菌體療法在嗜水氣單胞菌防治方面具有潛在優(yōu)勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)或自然感染的動(dòng)物中可成功治療嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病，即使只用單一噬菌體治療，仍有明顯的殺菌效果。研究表明，斑馬魚被感染嗜水氣單胞菌48 h后死亡率達(dá)96.67%，經(jīng)EASWARAN等[37]分離的對(duì)致病嗜水氣單胞菌具有強(qiáng)裂解作用的噬菌體pAh-1(MOI=10)處理后死亡率降低50%，證實(shí)口服噬菌體pAh-1可大大提高斑馬魚的存活率。為控制由多重耐藥嗜水氣單胞菌引起的鯉科泥鰍大規(guī)模死亡，從首爾漢江分離了2株噬菌體pAhl-C和pAh6-C，并評(píng)價(jià)其在實(shí)驗(yàn)性感染該菌過程中的治療潛力，結(jié)果表明，在2.6×106CFU/fish濃度處理下加入pAhl-C和pAh6-C治療，鯉科泥鰍的死亡率從39.17%分別降至17.50%和11.67%；在2.6×107CFU/fish濃度處理下加入pAhl-C和pAh6-C治療，死亡率從100%分別降至26.67%和39.17%，證明噬菌體pAhl-C和pAh6-C能有效預(yù)防和治療嗜水氣單胞菌引起的鯉科泥鰍大規(guī)模死亡[38]。然而，使用單一噬菌體控制特定病原體，很容易出現(xiàn)耐藥菌株[39-41]，菌株產(chǎn)生抗生素耐受的速度比噬菌體快10倍[42]。JUN等[38]研究發(fā)現(xiàn)，雖然噬菌體抑菌效果顯著，但體外抑菌試驗(yàn)顯示，pAhl-C和pAh6-C分別在12 h和6 h時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌再生現(xiàn)象，說明單個(gè)噬菌體用于治療有可能導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。

3.2 混合噬菌體治療

為了克服單個(gè)噬菌體治療有可能導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)的局限性，研究者提出噬菌體“雞尾酒”的想法，即將多個(gè)不同特性的噬菌體制成混合制劑。越來越多的研究表明，混合噬菌體治療是控制多重耐藥病原體的有效替代方案[39]。LE等[25]分離到對(duì)致病性嗜水氣單胞菌具有裂解作用的噬菌體Φ2和Φ5，試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照18.3%的存活率相比，使用噬菌體混合制劑處理后(MOI=100)，被試鯰魚的存活率顯著提高，達(dá)100%，證實(shí)利用噬菌體混合制劑控制嗜水氣單胞菌敗血癥的潛在可能性。但是，噬菌體“雞尾酒”也并不總是比單一噬菌體更有效。HOANG等[26]從鯰魚中分離到4株嗜水氣單胞菌噬菌體，篩選其中2株CT45P和TG25P用于噬菌體治療，結(jié)果表明，由2株噬菌體組成的“雞尾酒”能有效抑制細(xì)菌增殖，但與單一噬菌體處理相比，噬菌體“雞尾酒”的抑菌效果僅延長(zhǎng)1 h左右。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是宿主細(xì)菌在接觸噬菌體后會(huì)進(jìn)化出不同的噬菌體抗性機(jī)制，而有些噬菌體“雞尾酒”只是不同噬菌體的簡(jiǎn)單混合，并沒有考慮噬菌體所吸附細(xì)菌的受體差異[43]。因此，考慮噬菌體聯(lián)合抗生素治療將會(huì)是非常有價(jià)值的方法[44-46]。

3.3 噬菌體和抗生素聯(lián)合治療

噬菌體和抗生素可通過不同機(jī)制完成殺菌，如果二者聯(lián)合將可能產(chǎn)生一定協(xié)同效應(yīng)，減少耐藥菌株出現(xiàn)[45]。CHANDRARATHNA等[47]從鯉魚組織中分離出1株噬菌體AHP-1，并比較AHP-1、氯霉素(5 μg/mL)及噬菌體-抗生素聯(lián)合治療在體外試驗(yàn)中的抑菌效果，結(jié)果表明，單獨(dú)使用氯霉素3 h后觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)，AHP-1在15 h內(nèi)可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，聯(lián)合治療則在24 h內(nèi)抑菌效果高于其他2種處理方式；并得出結(jié)論，某些情況下低濃度抗生素與噬菌體混合可增強(qiáng)抑菌效果。因此，開發(fā)多種噬菌體與低劑量抗生素聯(lián)合應(yīng)用可能具有更好的應(yīng)用前景。

總體而言，目前關(guān)于嗜水氣單胞菌噬菌體的相關(guān)研究還不多，只有少數(shù)感染該菌的噬菌體進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和裂解性分析，其中包括噬菌體pAh1-C、pAh6-C、pAh-1、CT45P、TG25P、AHP-1、Akh-2和LAh1-10[13,26,37-38,47-48]。另外，噬菌體13AhydR10PP、14AhydR10PP、85AhydR10PP和25AhydR2PP有較寬的宿主域，且其基因組中未發(fā)現(xiàn)抗性基因和毒力基因[49]，噬菌體MJG、AhSzq-1和AhSzw-1也未檢測(cè)到抗性基因或毒力基因[50-51]，這些噬菌體均可作為防治嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的潛在藥物，作進(jìn)一步探索和研究。

4 研究展望

雖然利用噬菌體治療嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病優(yōu)勢(shì)明顯，但目前成熟的應(yīng)用研究還相對(duì)較少。想要讓噬菌體治療達(dá)到最佳防治效果，并將其廣泛應(yīng)用到臨床治療中，未來還可從以下幾個(gè)方面對(duì)嗜水氣單胞菌噬菌體開展相關(guān)研究：一是篩選更適合用于治療的原始噬菌體，分析噬菌體的生物學(xué)特性及基因組信息，了解噬菌體與宿主之間的相互作用方式，考察噬菌體在體外對(duì)病原菌的裂解效果，選擇潛伏期短、裂解量高、特異性強(qiáng)、理化性質(zhì)穩(wěn)定和突變頻率低的噬菌體作進(jìn)一步開發(fā)利用；二是通過分子生物學(xué)手段對(duì)噬菌體進(jìn)行基因改造，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)噬菌體進(jìn)行遺傳學(xué)水平的編輯已成為可能[52]，有研究[53-55]通過基因改造技術(shù)將噬菌體的部分基因進(jìn)行替換，成功改變了噬菌體原有的宿主域，未來可在基因編輯篩選優(yōu)良性狀方面作更多嘗試；三是制備噬菌體“雞尾酒”，噬菌體“雞尾酒”一般具有宿主域廣、裂解能力強(qiáng)等特性，可克服單一噬菌體抗菌譜窄的劣勢(shì)，降低耐藥菌株的出現(xiàn)頻率，是未來噬菌體治療的主要發(fā)展方向[40-42]；四是加深對(duì)噬菌體殺菌機(jī)制的認(rèn)識(shí)，彌補(bǔ)噬菌體治療的不足，噬菌體治療的基本原理是通過裂解宿主細(xì)菌達(dá)到殺菌目的，目前應(yīng)用最多的噬菌體裂解酶為內(nèi)溶素，可對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行溶解并釋放毒力因子[11,56-57]，未來這些酶可作為主要成分被用于抗菌性研究中。相信在不久的將來，噬菌體將會(huì)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為治療嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的另一條有效途徑。