超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定禽肉組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量

吳蓉 朱曉軍 周瑋 李潔莉 傅嘉星

摘 要：建立超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定禽肉組織中乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP）殘留量的分析方法。樣品用乙腈提取，采用C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），乙腈-水（30∶70，V/V）為流動(dòng)相，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，采用熒光檢測(cè)器，在激發(fā)波長(zhǎng)272 nm、發(fā)射波長(zhǎng)394 nm條件下測(cè)定。結(jié)果表明：ETP在5～500 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 7）;檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg;平均回收率為83.0%～91.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～2.9%。本方法適用于檢測(cè)禽肉組織中ETP殘留量。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜法;禽肉組織;乙氧酰胺苯甲酯;熒光檢測(cè)器

Abstract： An analytical method for the determination of ethopabate residues in poultry muscle tissues was established using ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence detection （UPLC-FLD）. Samples were extracted with acetonitrile and separated on a C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm） using a mobile phase consisting of acetonitrile and water （30：70， V/V） at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature and injection volume were set as 30 ℃ and 5.0 μL， respectively. The eluate was detected using a fluorescence detector at an excitation wavelength of 272 nm and an emission wavelength of 394 nm. The results showed that good linearity was observed in the concentration range of 5–500 ng/mL?（R2 = 0.999 7）. The limit of detection was 2 μg/kg， and the limit of quantitation was 5 μg/kg. The average recoveries of spiked samples were 83.0%–91.5% with relative standard deviation （RSD） of 1.6% to 2.9%. The method proved to be applicable for the determination of ethopabate residues in poultry muscle tissues.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; poultry muscle tissue; ethopabate; fluorescence detector

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200811-196

中圖分類號(hào)：O657.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）10-0053-05

乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP），又名4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯（結(jié)構(gòu)式見圖1），分子式為C12H15O4N，是一種廣譜抗球蟲增效劑[1-2]，常被添加在家禽飼料中，與其他抗球蟲藥物配伍使用，可以降低抗藥性，提高藥效[3-5]，因此，被廣泛用于預(yù)防和治療球蟲病[6]。

ETP在養(yǎng)殖行業(yè)長(zhǎng)期大量使用后易在動(dòng)物肌肉、肝、腎和蛋中殘留[7-8]，對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成潛在威脅[9-10]，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[11]規(guī)定，ETP在雞肉中最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為500 μg/kg，在雞肝和雞腎中MRL為1 500 μg/kg，但并未規(guī)定ETP在其他禽肉組織中的MRL。因此，探討并建立禽肉組織中ETP殘留量的檢測(cè)方法有利于加強(qiáng)養(yǎng)殖行業(yè)的監(jiān)管機(jī)制。

目前，我國現(xiàn)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)GB 31660.9—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 家禽可食性組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》[12]規(guī)定了家禽可食性組織中ETP殘留量的檢測(cè)方法，但該方法前處理繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，不適合樣品高通量分析。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)禽肉組織中ETP殘留量的方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[13-15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16-21]和熒光分光光度法[22-23]等。高效液相色譜-紫外檢測(cè)法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，但前處理需要使用固相萃取柱凈化[24-25]，成本較高，靈敏度較低，且儀器分析時(shí)間較長(zhǎng);液相色譜-質(zhì)譜法因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析[26-28]，但該法前處理繁瑣、耗時(shí)且儀器成本較高，更適用于多殘留測(cè)定;熒光分光光度法靈敏度高，但選擇性較差。

本研究以已報(bào)道文獻(xiàn)[18，24-25]為基礎(chǔ)，優(yōu)化前處理?xiàng)l件，采用乙腈進(jìn)行提取，利用熒光檢測(cè)器的強(qiáng)選擇性和高靈敏度特點(diǎn)，對(duì)雞、鴨、鵝肌肉組織中ETP殘留量進(jìn)行分析，建立禽肉組織中ETP殘留量測(cè)定的超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，國內(nèi)外鮮見相關(guān)報(bào)道，為禽肉組織中ETP殘留量的準(zhǔn)確測(cè)定和安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市售雞、鴨、鵝肌肉組織。無水硫酸鈉（分析純）、丙酮（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 德國默克股份兩合公司;正己烷（色譜純） 永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司;水均為超純水;ETP（純度≥98.83%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀、1260熒光檢測(cè)器、1290 InfinityⅡ FS二極管陣列檢測(cè)器 美國Agilent公司;PL2002電子天平 美國梅特勒-托利多儀器公司;SB-4200DTS超聲波雙頻清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Avanti JXN-26離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi Manschette公司;硅酸鎂固相萃取柱（1 g/6 mL） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量ETP標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取新鮮或解凍后的絞碎勻漿試樣5.0 g于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL乙腈和5 g無水硫酸鈉，渦旋混勻1 min，振蕩5 min，4 000 r/min低溫離心5 min，收集提取液于離心管，殘?jiān)?0 mL乙腈按照上述步驟重復(fù)提取1 次，合并2 次提取液，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩混勻后離心分層，取乙腈層60 ℃旋蒸至干，加入2.5 mL甲醇溶解（樣品中目標(biāo)物含量較高時(shí)，可用甲醇稀釋樣液），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作為待測(cè)液供超高效液相色譜儀分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相：乙腈、水體積比30∶70;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5.0 μL;熒光檢測(cè)器;激發(fā)波長(zhǎng)272 nm;發(fā)射波長(zhǎng)394 nm。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

樣品中目標(biāo)物含量按下式計(jì)算。

式中：X為樣品中目標(biāo)物含量/（μg/kg）;ρ為測(cè)試溶液中目標(biāo)物質(zhì)量濃度/（ng/mL）（由儀器工作站軟件直接計(jì)算得出）;V為試樣實(shí)際稀釋液總體積（2.5 mL）;m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜圖采用Agilent OpenLAB CDS-Acquisition軟件進(jìn)行采集，使用Agilent OpenLab Analysis軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法參數(shù)選擇

2.1.1 前處理方式的選擇

采用高效液相色譜法測(cè)定ETP含量時(shí)多采用硅酸鎂固相萃取柱。固相萃取的選擇性吸附和洗脫可以對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離及凈化，采用固相萃取柱能有效去除干擾雜質(zhì)，因此，常應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的樣品前處理步驟。以雞肌肉組織為空白基質(zhì)，添加50 μg/kg ETP標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈為提取試劑，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理。與采用硅酸鎂固相萃取柱的樣品前處理方法進(jìn)行對(duì)比分析，比較2 種前處理方式對(duì)ETP回收率的影響。

由圖2可知，2 種前處理方式均能有效分離目標(biāo)物，無明顯雜峰干擾，但選用本研究方法處理，目標(biāo)物峰面積較大，回收率更高。因此，選用本研究中前處理方法不僅簡(jiǎn)便、快速、節(jié)約成本，且回收率高、無明顯雜峰干擾。

2.1.2 旋蒸溫度的選擇

以雞肌肉組織為空白基質(zhì)，添加100 μg/kg ETP標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈為提取試劑，對(duì)比分析不同旋蒸溫度對(duì)ETP測(cè)定結(jié)果的影響。由圖3可知，旋蒸溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時(shí)，旋蒸溫度對(duì)ETP回收率幾乎沒有影響，因此，選擇60 ℃為本方法的最佳旋蒸溫度，不僅可以縮短前處理時(shí)間，還可以提高檢測(cè)效率。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測(cè)器的選擇

目前，現(xiàn)有液相色譜法測(cè)定ETP殘留量的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器適用性廣，但靈敏度低，雜質(zhì)峰干擾多且基線不平穩(wěn)，而熒光檢測(cè)器的高靈敏度和強(qiáng)選擇性彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)器的不足。由圖4可知，在激發(fā)波長(zhǎng)272 nm、發(fā)射波長(zhǎng)349 nm條件下，采用熒光檢測(cè)器測(cè)定ETP殘留量的響應(yīng)強(qiáng)度是紫外檢測(cè)器的近10 倍，因此，本研究選用熒光檢測(cè)器測(cè)定禽肉組織中ETP殘留量。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是熒光檢測(cè)的必要參數(shù)，通過儀器軟件參數(shù)設(shè)置，獲取目標(biāo)物的最優(yōu)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，可以很大程度地提高檢測(cè)靈敏度。由圖5可知，本方法的最佳熒光檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)272 nm，發(fā)射波長(zhǎng)349 nm。

2.3 線性方程、方法檢出限和定量限

采用外標(biāo)法對(duì)ETP進(jìn)行定量分析，按1.3.3節(jié)色譜條件，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得到回歸方程為y=0.109 5x+0.091 3（R2=0.999 7），該方法在質(zhì)量濃度5～500 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，滿足定量分析要求。

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，向空白基質(zhì)樣品中添加ETP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，以測(cè)定結(jié)果的3 倍信噪比（RS/N≥3）為檢出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比（RS/N≥10）為定量限（limit of quantification，LOQ），計(jì)算可得，方法LOD為2 μg/kg，LOQ為5 μg/kg。我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 31660.9—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 家禽可食性組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》[12]中規(guī)定，禽肌肉組織中ETP的LOD為20 μg/kg，LOQ為50 μg/kg，均大于本研究測(cè)定值，因此，本方法具備更靈敏的定量檢測(cè)能力，滿足禽肉組織中ETP殘留量的分析要求。

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

為考察本方法的準(zhǔn)確度和精密度，選擇不同基質(zhì)樣品（雞肉、鴨肉、鵝肉），以5、50、500 μg/kg（方法LOQ、選一合適點(diǎn)、國標(biāo)最高殘留限量）3 個(gè)水平將ETP添加到陰性基質(zhì)樣品中，每組6 個(gè)平行。

由表1可知，各基質(zhì)樣品中ETP平均回收率為83.0%～91.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～2.9%，表明該法準(zhǔn)確度高、精密度好，能滿足獸藥殘留[29]定量分析要求和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控[30]要求。

3 結(jié) 論

建立超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定肉類食品中ETP殘留量。綜合現(xiàn)有分析方法，簡(jiǎn)化了前處理步驟，優(yōu)化了儀器參數(shù)，確立了LOD和LOQ，提高了方法靈敏度和準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法具有前處理操作簡(jiǎn)單、成本低、重復(fù)性好、靈敏度和準(zhǔn)確度高、基線平穩(wěn)、雜峰干擾小等特點(diǎn)，解決了現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中前處理繁瑣耗時(shí)、成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)等問題。本研究方法的建立有利于樣品的通量分析，提高了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率，為測(cè)定肉類食品中ETP殘留量提供了可靠、準(zhǔn)確的分析方法。

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