基于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的多重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法鑒別當(dāng)雄高山牦牛肉

劉睿茜 其美次仁 李家鵬 韋憶萱 李金春 王守偉

摘 要：通過比對(duì)5 個(gè)不同地區(qū)牦牛線粒體基因的差異，篩選出用于鑒定當(dāng)雄高山牦牛的11 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)，將這些SNP位點(diǎn)作為引物3′端，同時(shí)引入引物堿基錯(cuò)配理念，設(shè)計(jì)出8 對(duì)特異性引物，構(gòu)建出2 個(gè)三重和1 個(gè)二重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）體系，建立一種基于SNP位點(diǎn)和多重RT-PCR技術(shù)鑒別當(dāng)雄高山牦牛肉的方法。結(jié)果表明：該方法特異性較好、簡便快捷、結(jié)果直觀可靠，能夠有效鑒別當(dāng)雄高山牦牛肉;方法中3 個(gè)RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的熔解溫度（melting temperature，Tm）范圍分別為反應(yīng)體系A(chǔ)：73.1～75.2、76.0～77.3、79.0～80.0 ℃，反應(yīng)體系B：69.5～72.8、75.0～77.9、78.5～80.0 ℃，反應(yīng)體系C：76.1～78.1、79.5～80.7 ℃;根據(jù)3 個(gè)反應(yīng)體系中熔解曲線峰的有無以及Tm是否符合取值范圍來判定樣品是否為當(dāng)雄高山牦牛肉;市售樣品測(cè)定結(jié)果表明，該方法可用于實(shí)際樣品中當(dāng)雄高山牦牛肉的快速鑒別。

關(guān)鍵詞：當(dāng)雄高山牦牛;品種鑒別;單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn);多重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);熔解曲線

Abstract： By comparing the difference in the mitochondrial gene of yaks from five different regions， 11 single nucleotide polymorphism （SNP） loci were selected for identification of the meat of Dangxiong alpine yaks. Utilizing the SNP loci as the 3 end of primers， and introducing the concept of base mismatch， 8 pairs of specific primers were designed to construct two triplex and one duplex real time polymerase chain reaction （RT-PCR） reaction systems. An SNP-based multiplex RT-PCR method was finally established to identify the meat of Dangxiong alpine yaks. The melting temperatures （Tm） of the three RT-PCR reaction systems were reaction A： 73.1–75.2， 76.0–77.3， and 79.0–80.0 ℃; reaction B： 69.5–72.8， 75.0–77.9， and 78.5–80.0 ℃; and reaction C： 76.1–78.1， and 79.5–80.7 ℃， respectively. The determination of whether an unknown sample was the meat of Dangxiong alpine yaks was dependent on the presence or absence of melting curve peaks in the three reaction systems and whether the peaks corresponded to the Tm ranges. The method was successfully applied to the rapid identification of real samples.

Keywords： Dangxiong alpine yak; breed identification; single nucleotide polymorphisms locus; multiplex real-time polymerase chain reaction; melting curve

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200917-228

中圖分類號(hào)：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）10-0047-06

牦牛是一種珍稀的畜種資源，可適應(yīng)高海拔、低氣壓的氣候條件，且具有耐寒、耐勞、耐粗飼的優(yōu)點(diǎn)。苛刻的生存環(huán)境造就了牦牛肉特有的品質(zhì)，牦牛肉色澤深紅、富含蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，具有低脂肪、高營養(yǎng)、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特性，越來越受到消費(fèi)者的青睞[1-2]。我國牦牛產(chǎn)區(qū)眾多，主要分布于青海、四川、甘肅、西藏、云南和新疆等以青藏高原為中心的高原地帶[3-5]。各個(gè)產(chǎn)地的牦牛經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育形成了不同的品種[2，6]。當(dāng)雄高山牦牛是當(dāng)?shù)厝嗣窠?jīng)過長達(dá)300多年選育出的優(yōu)良品種，2016年被認(rèn)定為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。當(dāng)雄高山牦牛在生產(chǎn)性能、畜產(chǎn)品品質(zhì)和遺傳穩(wěn)定性上相比其他牦牛品種具有一定優(yōu)勢(shì)[7]。王琳琳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雄縣的高山牦牛肉在食用品質(zhì)上優(yōu)于麥洼牦牛肉。然而，不同地區(qū)牦牛因品牌知名度、市場(chǎng)接受度等不盡相同，導(dǎo)致牦牛肉價(jià)格也存在一定差異。低價(jià)肉冒充高價(jià)肉、普通產(chǎn)品冒充地理標(biāo)志產(chǎn)品的欺詐行為，不僅侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，也對(duì)當(dāng)?shù)仃笈．a(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了負(fù)面影響[9-11]。因此，為保護(hù)牦牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，亟需開展當(dāng)雄高山牦牛品種鑒定方法相關(guān)研究。

動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)通常建立在蛋白質(zhì)、DNA等分子結(jié)構(gòu)、序列或組成特異性分析的基礎(chǔ)上[12-13]。相對(duì)于蛋白質(zhì)而言，DNA具有較高的熱穩(wěn)定性和普遍存在性，使得基于DNA序列的動(dòng)物源性成分鑒別方法得到更加廣泛的開發(fā)和應(yīng)用[14-16]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被認(rèn)為是此類方法中鑒別動(dòng)物源性成分的理想工具[17-18]，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）因操作簡便、可實(shí)時(shí)反映目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增情況，近些年被大量應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的定性和定量分析[19-21]。RT-PCR技術(shù)主要包括探針法和染料法[22]，相比于探針法，染料法更加簡單、節(jié)約成本[23]，而熔解曲線分析是染料法中常用的結(jié)果分析手段，通過不同的熔解溫度（melting temperature，Tm）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的定性鑒別。凌睿等[24]使用SYBR Green染料法，通過熔解曲線中豬（（82.03±0.25） ℃）、羊（（78.83±0.16） ℃）擴(kuò)增產(chǎn)物Tm的不同對(duì)以豬肉摻假羊肉的混合物進(jìn)行檢測(cè)。Ishida等[25]通過線粒體DNA使用熔解曲線Tm分析法，應(yīng)用2 個(gè)多重RT-PCR反應(yīng)可鑒別多個(gè)動(dòng)物物種。

目前，有關(guān)牦牛肉鑒別的研究主要是針對(duì)牦牛與普通牛等其他物種之間的鑒別。段慶梓等[9]利用細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cyt b）基因設(shè)計(jì)牦牛特異性引物，對(duì)摻有豬肉、水牛肉和黃牛肉混合肉樣中的牦牛源性成分進(jìn)行了有效鑒別。Zhao Jie等[11]利用等位基因特異性PCR技術(shù)，通過10 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)對(duì)牦牛肉和普通牛肉進(jìn)行了區(qū)分。而不同品種牦牛肉之間鑒別方法的報(bào)道還很少。不同品種的牦牛由于氣候、海拔、植被和礦物質(zhì)等生長環(huán)境不盡相同，在長期的自然選擇過程中，牦牛的遺傳物質(zhì)DNA會(huì)發(fā)生不同程度、不同方向的變異，導(dǎo)致不同品種牦牛DNA中的個(gè)別堿基存在多態(tài)性[26-27]。有研究表明，利用多基因、多SNP位點(diǎn)組合以及多重PCR技術(shù)進(jìn)行物種鑒別可以提高鑒別效率、準(zhǔn)確度，節(jié)約成本[28-29]。

本研究采集西藏當(dāng)雄縣、青海久治縣、青海祁連縣、四川紅原縣和甘肅甘南州5 個(gè)地區(qū)的牦牛肉樣品，通過對(duì)線粒體基因進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出11 個(gè)用于鑒定當(dāng)雄高山牦牛肉的SNP位點(diǎn)，并以這些SNP位點(diǎn)作為引物3′端，設(shè)計(jì)出8 對(duì)特異性引物，最終建立一種基于SNP位點(diǎn)和多重RT-PCR技術(shù)鑒別當(dāng)雄高山牦牛肉的方法。通過比較3 個(gè)反應(yīng)體系熔解曲線峰的有無及Tm是否符合取值范圍，來判定樣品是否為當(dāng)雄高山牦牛肉，對(duì)于西藏當(dāng)雄牦牛的合理開發(fā)、利用及地理標(biāo)志性的保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)雄高山牦牛肉（霖肉，5 歲齡，32 份，1 kg/份） 西藏當(dāng)雄縣凈土牦牛產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司;其他地區(qū)牦牛肉（5 歲齡，68 份，1 kg/份）：青海久治地區(qū)（久治牦牛，霖肉，20 份）、青海祁連地區(qū)（環(huán)湖牦牛，霖肉，14 份）、四川紅原地區(qū)（麥洼牦牛，脊肉，14 份）和甘肅甘南州地區(qū)（安多牦牛，脊肉，20 份）;市售當(dāng)雄牦牛肉（15 份，1 kg/份） 當(dāng)雄縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和拉薩市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

DNA提取試劑盒 德國Qiagen公司;瓊脂糖?西班牙Biowest公司;D2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司;PrimeSTAR? HS（Premix） 寶生物工程（大連）有限公司;LightCycler? 480 SYBR? Green I Master酶體系預(yù)混液 德國Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Omni Prep多樣品勻漿儀 美國Omni公司;NanoDrop One超微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher公司;PCR儀、Biorad GelDoc XR凝膠成像儀?美國Bio-Rad公司;LightCycler 480熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;5417離心機(jī) 艾本德（中國）有限公司;DYCP-31F瓊脂糖水平電泳儀?北京六一儀器廠;Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA的提取

參考Li Jinchun等[30]所述方法進(jìn)行樣品DNA提取。

1.3.2 線粒體基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫下載青藏高原牦牛（Bos_grunniens，GenBank：KR011113.1）線粒體基因全序列，通過Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)出6 對(duì)用于擴(kuò)增牦牛線粒體基因（16S rRNA、Cyt b、COⅢ、ND1、ND4、ND5）的引物（表1）。

1.3.3 線粒體基因擴(kuò)增與測(cè)序

根據(jù)6 對(duì)線粒體基因引物，分別對(duì)32 份當(dāng)雄高山牦牛肉樣品和68 份其他地區(qū)牦牛肉樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（30 μL）：Premix 15 μL、上游引物（5 μmol/L）3 μL、下游引物（5 μmol/L）3 μL、模板（5 ng/μL）2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至30 μL。普通PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸105 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠在100 V電壓條件下進(jìn)行電泳，PCR產(chǎn)物上樣量5 μL，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1 cm處時(shí)停止電泳;電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上成像，以檢測(cè)有無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物委托英濰捷基（上海）有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 SNP位點(diǎn)篩選

將不同地區(qū)牦牛線粒體基因進(jìn)行對(duì)比分析，篩選SNP位點(diǎn)。SNP位點(diǎn)篩選原則：以32 頭當(dāng)雄高山牦牛保守序列為目標(biāo)區(qū)域，篩選對(duì)應(yīng)區(qū)域中其他牦牛線粒體堿基多態(tài)性高的位點(diǎn)，用于構(gòu)建當(dāng)雄高山牦牛鑒別方法。

1.3.5 鑒定當(dāng)雄高山牦牛肉的引物設(shè)計(jì)

將篩選出的SNP位點(diǎn)作為鑒別當(dāng)雄高山牦牛引物的3′端，將11 個(gè)SNP位點(diǎn)（表2）分別設(shè)計(jì)在8 對(duì)引物中并分組到3 個(gè)反應(yīng)體系中，包括2 個(gè)三重反應(yīng)體系（A、B）和1 個(gè)二重反應(yīng)體系（C）。為了提高當(dāng)雄高山牦牛引物的特異性和抑制非特異性擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)過程中引入堿基錯(cuò)配理念[31]，在部分引物SNP位點(diǎn)的前一位引入錯(cuò)配堿基（表2）：DX-P2-R引物中由堿基T變?yōu)锳;DX-P4-R引物中堿基A變?yōu)镃;DX-P5-R引物中堿基G變?yōu)門;DX-P7-R引物中堿基A變?yōu)門。引物合成委托英濰捷基（上海）有限責(zé)任公司進(jìn)行。

1.3.6 多重RT-PCR反應(yīng)體系及條件

鑒別當(dāng)雄地區(qū)牦牛肉的反應(yīng)體系由2 個(gè)三重RT-PCR反應(yīng)和1 個(gè)二重RT-PCR反應(yīng)組成。多重RT-PCR反應(yīng)體系總量為25 μL，組分及配比如表3所示。多重RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，30 個(gè)循環(huán)，95 ℃變性10 s，57 ℃退火和延伸45 s;熔解曲線制作過程為：95 ℃、1 min，65 ℃、1 min，以0.02 ℃/s速率升溫至95 ℃，同時(shí)連續(xù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，最后冷卻（40 ℃、1 min）。

1.3.7 多重RT-PCR體系特異性檢驗(yàn)

為考察多重RT-PCR體系特異性，分別隨機(jī)提取西藏當(dāng)雄地區(qū)、青海久治地區(qū)、青海祁連地區(qū)、四川紅原地區(qū)和甘肅甘南州地區(qū)各3 個(gè)牦牛肉樣品的DNA，將DNA樣品質(zhì)量濃度均稀釋至0.5 ng/μL，作為檢測(cè)模板。然后同時(shí)進(jìn)行2 個(gè)三重和1 個(gè)二重RT-PCR熔解曲線分析。通過比較3 個(gè)反應(yīng)體系熔解曲線峰的個(gè)數(shù)以及Tm是否符合取值范圍，來判定多重RT-PCR體系特異性。

1.3.8 多重RT-PCR體系的應(yīng)用

將15 份于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的當(dāng)雄牦牛樣品按照1.3.1節(jié)樣品DNA的提取方法進(jìn)行處理，制備成待測(cè)模板，再根據(jù)1.3.6節(jié)多重RT-PCR反應(yīng)體系及條件對(duì)15 個(gè)樣品模板進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過LightCycler? 480軟件中Tm Calling分析得到Tm和熔解曲線圖，該曲線以Tm為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)強(qiáng)度（F）對(duì)Tm的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)（-dF/dTm）為縱坐標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛線粒體基因擴(kuò)增結(jié)果

為驗(yàn)證牦牛線粒體基因測(cè)序引物的擴(kuò)增效果，挑選部分樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，ND4和ND5基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，大小與表1中產(chǎn)物大小一致，未發(fā)生非特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析，用于篩選SNP位點(diǎn)。

2.2 SNP位點(diǎn)篩選和引物設(shè)計(jì)

以當(dāng)雄高山牦牛保守序列為目標(biāo)區(qū)域，篩選對(duì)應(yīng)區(qū)域中其他牦牛線粒體堿基多態(tài)性較高的位點(diǎn)，最終篩選出11 個(gè)SNP位點(diǎn)，所有SNP位點(diǎn)分布在16S rRNA、Cyt b、COⅢ、ND1、ND4、ND5共計(jì)6 個(gè)線粒體基因上，SNP位點(diǎn)物理位置及堿基分布情況見表4，其中物理位置參考青海高原牦牛線粒體基因組序列（GenBank：KR011113.1）確定。將這些SNP位點(diǎn)作為引物3′端，設(shè)計(jì)出8 對(duì)特異性引物，用于構(gòu)建多重RT-PCR體系。

2.3 多重RT-PCR體系構(gòu)建

在多重RT-PCR體系構(gòu)建過程中，為避免多重RT-PCR體系中引物之間的交叉反應(yīng)而導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，相同或相鄰線粒體基因上的引物應(yīng)當(dāng)分組到不同RT-PCR反應(yīng)體系中。另外，為防止熔解曲線峰重疊而無法區(qū)分，相鄰熔解曲線峰對(duì)應(yīng)的ΔTm應(yīng)大于其最小限值。Hernandez[32]、Ririe[33]等研究發(fā)現(xiàn)，二重RT-PCR中ΔTm為1.5 ℃或2 ℃時(shí)，均可通過峰圖對(duì)2 種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分?；谝陨? 點(diǎn)原因，將8 對(duì)引物分組到2 個(gè)三重和1 個(gè)二重RT-PCR反應(yīng)體系中（表2）。

以當(dāng)雄高山牦牛肉為陽性樣品，各反應(yīng)體系中模板為滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照，分別進(jìn)行3 個(gè)多重RT-PCR反應(yīng)，得到8 個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線峰圖，由圖2可知，反應(yīng)體系A(chǔ)和B均出現(xiàn)3 個(gè)峰，反應(yīng)體系C出現(xiàn)2 個(gè)峰。

單重RT-PCR到多重RT-PCR反應(yīng)過程中，由于引物之間的競爭及引物與模板之間的競爭，相同擴(kuò)增產(chǎn)物的含量也不盡相同，導(dǎo)致其Tm存在明顯差異[34]。統(tǒng)計(jì)當(dāng)雄高山牦牛肉各反應(yīng)體系中擴(kuò)增產(chǎn)物Tm的溫度范圍，反應(yīng)體系A(chǔ)擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的Tm范圍分別為73.1～75.2、76.0～77.3、79.0～80.0 ℃;反應(yīng)體系B擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的Tm范圍分別為69.5～72.8、75.0～77.9、78.5～80.0 ℃;反應(yīng)體系C擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的Tm范圍分別為76.1～78.1、79.5～80.7 ℃。當(dāng)樣品經(jīng)過上述3 個(gè)多重RT-PCR體系出現(xiàn)上述8 個(gè)熔解峰，且各Tm均在相應(yīng)溫度范圍之內(nèi)時(shí)，則可判定為當(dāng)雄牦牛肉陽性樣品，否則判定為非當(dāng)雄牦牛肉樣品。

2.4 多重RT-PCR體系特異性檢驗(yàn)

為驗(yàn)證多重RT-PCR反應(yīng)體系的特異性，隨機(jī)選取5 個(gè)地區(qū)不同品種牦牛肉樣品進(jìn)行驗(yàn)證，由表5可知，所有樣品的Tm均在陽性樣品Tm范圍內(nèi)，其中當(dāng)雄牦牛肉樣品熔解曲線峰達(dá)到8 個(gè)，其他4 個(gè)地區(qū)的非當(dāng)雄牦牛肉樣品熔解曲線峰均少于8 個(gè)。例如，久治牦牛肉樣品1缺少體系B中的第3個(gè)熔解曲線峰（峰6），可推斷該樣品在SNP7位點(diǎn)的堿基不是G，或SNP8位點(diǎn)的堿基不是C，因此該方法可以達(dá)到通過符合Tm范圍的熔解曲線峰的有無來判斷各SNP位點(diǎn)的基因型，進(jìn)而判斷樣品是否為當(dāng)雄高山牦牛肉的目的。經(jīng)過驗(yàn)證，當(dāng)雄高山牦牛肉樣品均出現(xiàn)8 個(gè)熔解曲線峰，且Tm符合取值范圍，而非當(dāng)雄高山牦牛肉樣品熔解曲線峰均少于8 個(gè)，說明該多重RT-PCR體系具有良好的特異性。

2.5 市售當(dāng)雄牦牛肉樣品檢測(cè)

為檢驗(yàn)該方法的實(shí)際鑒別能力，對(duì)從拉薩市和當(dāng)雄縣當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買的15 個(gè)當(dāng)雄牦牛肉樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過分析熔解曲線峰圖發(fā)現(xiàn)，其中的11 個(gè)市售當(dāng)雄牦牛肉樣品均出現(xiàn)8 個(gè)熔解曲線峰，Tm范圍分別為反應(yīng)體系A(chǔ)：73.3～74.1、76.2～76.6、79.0～79.6 ℃;反應(yīng)體系B：70.0～71.0、75.2～76.4、78.9～79.5 ℃;反應(yīng)體系C：76.4～76.9、79.7～80.0 ℃，均符合判定標(biāo)準(zhǔn)中Tm的范圍，因此判定該11 個(gè)市售樣品為當(dāng)雄高山牦牛肉。而剩余4 個(gè)市售樣品缺失反應(yīng)體系B中Tm 78.5～80.0 ℃的第3 個(gè)熔解曲線峰（峰6）（表6），因此判定該4 個(gè)樣品為非當(dāng)雄高山牦牛肉。通過此方法驗(yàn)證的市售樣品中，有26.67%的當(dāng)雄牦牛肉并非真實(shí)的當(dāng)雄高山牦牛肉。

3 結(jié) 論

本研究開發(fā)了一種基于SNP位點(diǎn)和3 個(gè)多重RT-PCR反應(yīng)體系熔解曲線分析鑒別當(dāng)雄高山牦牛肉的方法，結(jié)果表明：3 個(gè)RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的Tm范圍分別為反應(yīng)體系A(chǔ)：73.1～75.2、76.0～77.3、79.0～80.0 ℃，反應(yīng)體系B：69.5～72.8、75.0～77.9、78.5～80.0 ℃，反應(yīng)體系C：76.1～78.1、79.5～80.7 ℃，根據(jù)3 個(gè)反應(yīng)體系中熔解曲線峰的有無以及Tm是否符合取值范圍，來鑒定樣品是否為當(dāng)雄高山牦牛肉。該方法具有良好的特異性，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。同時(shí)，該方法具有操作簡便、成本低、結(jié)果直觀可靠的優(yōu)點(diǎn)，有利于推廣應(yīng)用。該方法的建立將對(duì)保護(hù)當(dāng)雄高山牦牛作為地理標(biāo)志性產(chǎn)品、提升品牌價(jià)值、促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)穩(wěn)健發(fā)展起到重要作用。

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