胰蛋白酶對豬血紅蛋白酶解脫色條件優(yōu)化

姚倫歡 郝剛 唐善虎 李思寧

摘 要：以酶解液水解度（hydrolysis degree，DH）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性氮含量及血紅素殘留量為評定指標(biāo)，采用單因素試驗比較胰蛋白酶和堿性蛋白酶對豬血紅蛋白的酶解脫色效果。在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平正交試驗。結(jié)果表明：胰蛋白酶水解脫色的效果更好，最佳酶解工藝參數(shù)為酶底比7 500 U/g、酶解溫度45 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL，在此條件下，酶解液DH為25.67%，TCA可溶性氮含量為80.05%，血紅素殘留量為18.34%，豬血紅蛋白多肽粉蛋白含量83.17%;對此條件下制備的豬血紅蛋白多肽粉進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析，分子質(zhì)量在1 000 Da以下的小肽占比94.20%;最佳酶解脫色條件下，豬血紅蛋白多肽粉中TCA可溶性氮含量為80.05%的蛋白占豬血紅蛋白多肽粉蛋白含量的96.25%，這與分子質(zhì)量分布結(jié)果比較符合。

關(guān)鍵詞：豬血紅蛋白;酶解;水解度;三氯乙酸可溶性氮;血紅素

Abstract： This study comparatively evaluated the decolorization efficiency of porcine hemoglobin with trypsin and alkaline protease based on hydrolysis degree （DH）， trichloroacetic acid （TCA） soluble nitrogen content and heme residue. Trypsin was determined to be more suitable for decolorizing porcine hemoglobin than alkaline protease. Using a four-factor， three-level orthogonal array design， the optimal hydrolysis conditions for decolorizing porcine hemoglobin by trypsin were determined as follows： enzyme/substrate ratio 7 500 U/g， temperature 45 ℃， pH 7.5， and substrate concentration?8 g/100 mL. Under these conditions， the DH was 25.67%， and the TCA soluble nitrogen content， heme residue and total protein content of the peptide obtained powder were 80.05%， 18.34% and 83.17%， respectively. Molecular mass distribution analysis showed that small peptides with molecular masses less than 1 000 Da accounted for 94.20% of the peptide powder. TCA soluble nitrogen accounted for 96.25% of the protein content in the peptide powder， which is quite consistent with the results of molecular mass distribution.

Keywords： porcine hemoglobin; enzymatic hydrolysis; degree of hydrolysis; trichloroacetic acid soluble nitrogen; heme

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200904-217

中圖分類號：TS251.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0019-07

豬血是生豬屠宰加工過程中的副產(chǎn)物之一，每頭豬的豬血約占體質(zhì)量的3.0%～3.5%[1]。豬血中蛋白質(zhì)含量高達(dá)17%～21%，高于人乳和全蛋，其氨基酸組成平衡，含人體所需的8 種必需氨基酸在內(nèi)的18 種氨基酸，尤以賴氨酸和亮氨酸含量較高[2-3]，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。豬血紅細(xì)胞的蛋白含量高達(dá)38%，其中92%以上是血紅蛋白，但由于色澤猩紅、腥味重、適口性差等特點[4]，我國對豬血紅蛋白的利用率并不高，除小部分被加工成血粉或發(fā)酵血粉作為飼料添加劑及用于生化制藥生產(chǎn)血紅素、超氧化物歧化酶、蛋白胨外，相當(dāng)大一部分被作為廢棄物，既造成巨大浪費，又污染環(huán)境。隨著酶技術(shù)的迅速發(fā)展，利用蛋白酶水解豬血紅蛋白以提高其利用率的研究也越來越多[5-7]，開展血紅蛋白的精深加工研究對大規(guī)模利用血紅蛋白資源具有重要意義。

血紅蛋白經(jīng)酶解技術(shù)水解而成的血紅蛋白多肽，不僅分子質(zhì)量小，有很好的溶解性、低黏度、抗凝膠形成性，而且在體內(nèi)消化吸收快、蛋白質(zhì)利用率高、具有低抗原性、不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)[8]。豬血紅蛋白肽的蛋白質(zhì)含量在80%以上，利用率在90%以上，具有抗氧化[9-10]、抗菌[11-12]、降血壓[13-15]、降血脂[16]、緩解疲勞[17]、改善免疫功能[18-19]、改善缺鐵性貧血[20-21]等重要生理活性。

目前，國內(nèi)外豬血紅蛋白脫色的方法主要有有機溶劑法、氧化法、高分子化合物絮凝法、機械法、綜合法和蛋白酶水解法等，蛋白酶水解脫色被認(rèn)為是最環(huán)保的一種方法，該方法不使用有機溶劑、實驗設(shè)備要求簡單、操作安全、副反應(yīng)少、成本低、易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。血紅蛋白經(jīng)過酶解、酸沉去除血紅素后會產(chǎn)生脫色效果[22]，因此血紅蛋白多肽很適合用于食品的營養(yǎng)強化、調(diào)整食品的結(jié)構(gòu)、口感以及產(chǎn)品的色澤和外觀，是一種非常有應(yīng)用前景的食品原料。在歐美、日本等發(fā)達(dá)國家，豬血的利用率已達(dá)50%以上，主要是開發(fā)肽類試劑、肽類藥物、功能性食品和食品添加劑[23]。本研究以水解度（hydrolysis degree，DH）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性氮含量及血紅素殘留量為指標(biāo)，比較研究胰蛋白酶和堿性蛋白酶對豬血紅蛋白的酶解脫色效果，優(yōu)化得到最佳水解工藝條件，并對最佳水解條件下制備的血紅蛋白多肽進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬血：于某屠宰公司屠宰過程中采集血液，并迅速加入檸檬酸鈉（5 g/L）抗凝，4 ℃保存。

胰蛋白酶（250 U/mg）（生物試劑） 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;堿性蛋白酶（200 U/mg）（生物試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS） 美國Sigma公司;血紅素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;L-亮氨酸（生物試劑）、磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ85-2磁力攪拌器 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SB-5200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;MP511 Lab pH計 上海三信儀表廠;BSA124S-CW電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;UV1810S紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;K9860全自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;Centrifuge 5804離心機 德國Eppendorf公司;Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血紅蛋白多肽的制備工藝流程

新鮮豬血用4 層紗布過濾除雜，4 ℃、8 000×g離心10 min，收集下層血球，按照設(shè)計好的比例加入一定量的水，超聲溶血20 min，用1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)恒溫磁力攪拌器溫度，加入蛋白酶攪拌酶解，酶解結(jié)束后100 ℃沸水浴10 min滅酶，快速冷卻至室溫，4 000×g離心10 min，收集上清液即為酶解液，取1 mL測定DH。調(diào)節(jié)酶解液pH值至4，升高溫度至95 ℃保持至沉淀產(chǎn)生，4 000×g離心10 min，收集上清液進(jìn)行干燥，烘干至恒質(zhì)量的多肽樣品研磨成細(xì)粉，用于測定TCA可溶性氮含量及血紅素殘留量。選出最佳工藝參數(shù)后在最佳工藝條件下用相同方法制備豬血紅蛋白多肽粉，分別測定其DH、TCA可溶性氮含量、血紅素殘留量及分子質(zhì)量分布。

1.3.2 血紅蛋白酶解單因素試驗

1.3.2.1 酶底比對酶解脫色效果的影響

取10 組，分別按2 500、5 000、7 500、10 000、12 500 U/g酶底比加入胰蛋白酶和堿性蛋白酶，酶解溫度50 ℃、pH 7.0、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、酶解時間5 h。

1.3.2.2 酶解溫度對酶解脫色效果的影響

取10 組，2 種酶分別在40、45、50、55、60 ℃條件下進(jìn)行酶解，酶底比7 500 U/g、pH 7.0、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、酶解時間5 h。

1.3.2.3 pH值對酶解脫色效果的影響

取10 組，2 種酶分別在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下進(jìn)行酶解，酶底比7 500 U/g、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、酶解時間5 h，胰蛋白酶酶解溫度45 ℃、堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃。

1.3.2.4 底物質(zhì)量濃度對酶解脫色效果的影響

取10 組，2 種酶分別在底物質(zhì)量濃度4、6、8、10、12 g/100 mL條件下進(jìn)行酶解，酶底比7 500 U/g、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、酶解時間5 h，胰蛋白酶酶解溫度45 ℃、pH 7.5，堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃、pH 8.0。

1.3.3 血紅蛋白酶解正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以DH、TCA可溶性氮含量及血紅素殘留量為指標(biāo)，對酶底比、酶解溫度、pH值和底物質(zhì)量濃度4 個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗。

1.3.4 DH測定

對Adler-Nissen[24]、焦宇知[25]等的方法稍加修改。取1 mL酶解液加入15 mL 1 g/100 mL 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，70 ℃保溫15 min，從中取0.1 mL溶液加入4.5 mL 1 g/100 mL SDS溶液中得待測液。吸取0.1 mL待測液，加入2 mL 50 ℃預(yù)熱的0.2 mol/L、pH 8.2磷酸緩沖液，加入1 mL 1 g/100 mL TNBS溶液，50 ℃避光反應(yīng)60 min，加入4 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)，室溫靜置30 min后于340 nm波長處比色，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。以1 g/100 mL SDS溶液作為樣品空白。用L-亮氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以L-亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)（mmol/L），吸光度為縱坐標(biāo)，所得回歸方程為y=0.316 7x-0.008 8（R2=0.992）。DH按式（1）計算。

式中：c為L-亮氨酸濃度/（mmol/L）;A為待測樣品在340 nm波長處的吸光度;n為稀釋倍數(shù);V為酶解液總體積/L;m為酶解樣品質(zhì)量/g;C為酶解樣品的蛋白質(zhì)含量（經(jīng)凱氏定氮法直接測定）/%;htot為原料蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)，豬血紅蛋白為8.3 mmol/g。

1.3.5 TCA可溶性氮含量測定

根據(jù)方俊[26]的方法稍加修改。準(zhǔn)確稱取1 g多肽粉樣品，加入10 mL 10 g/100 mL TCA溶液，混合振蕩后靜置30 min，4 000×g離心10 min，用凱氏定氮法測定上清液中氮含量。

1.3.6 血紅素殘留量測定

采用紫外分光光度法[27]，取0.2 g豬血紅蛋白多肽粉樣品，用0.l mol/L NaOH定容至100 mL，吸取10 mL用0.l mol/L NaOH定容至100 mL，以0.l mol/L NaOH作空白調(diào)零，于385 nm波長處測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。用血紅素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以血紅素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），以吸光度為縱坐標(biāo)，所得回歸方程為y=0.059 6x-0.008 6（R2=0.999）。血紅素殘留量按式（2）計算。

式中：V1為吸取樣品溶液體積/mL;V2為樣品定容體積/mL;m1為由回歸方程換算得到血紅素的量/g;m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.7 血紅蛋白多肽分子質(zhì)量分布測定

根據(jù)吳悅[28]、姜惠敏[29]等的方法測定血紅蛋白多肽分子質(zhì)量分布。稱取適量烘干至恒質(zhì)量的血紅蛋白多肽樣品，溶于超純水中，溶液質(zhì)量濃度為0.015 7 g/mL，10 000×g離心20 min得上清樣液。吸取樣液2 mL，用流動相稀釋至100 mL，用直徑0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

色譜條件如下：Waters 600高效液相色譜儀（配2487紫外檢測器和M32工作站）;TSKgel 2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）;柱溫25 ℃;流動相：乙腈、水、三氟乙酸體積比45∶55∶0.1;檢測波長220 nm;流速0.5 mL/min。數(shù)據(jù)處理及計算由Waters M32GPC軟件自動進(jìn)行。

以細(xì)胞色素C（Mw=12 500 Da）、抑肽酶（Mw=6 500 Da）、桿菌酶（Mw=1 450 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（Mw=451 Da）、Gly-Gly-Gly（Mw=189 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，做分子質(zhì)量（Mw）校正曲線，得到分子質(zhì)量與保留時間（t）的回歸方程為lgMw=5.441 8-0.054 1t（r=0.996 0，P<0.01）。各標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對數(shù)值與其保留時間具有良好的線性關(guān)系，可以準(zhǔn)確測定水解物中多肽的分子質(zhì)量分布。根據(jù)氨基酸平均分子質(zhì)量為128 Da，多肽分子質(zhì)量除以128所得數(shù)值為多肽大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為平行測定3 次所得平均值，并計算標(biāo)準(zhǔn)差。運用Excel 2010軟件進(jìn)行圖表處理、用SPSS 25軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗（Duncans法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血紅蛋白酶解脫色單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 酶底比對豬血紅蛋白酶解脫色效果的影響

由圖1可知，各組酶解液的DH、TCA可溶性氮含量和血紅素殘留量隨酶底比的變化差異顯著（P<0.05），各組酶解液的DH和TCA可溶性氮含量均隨酶底比的增加而增加，而血紅素殘留量則隨酶底比的增加而減小。酶底比超過7 500 U/g后，DH和TCA可溶性氮含量隨酶底比的增加仍有所上升，但增幅較小，血紅素殘留量的下降幅度也較小。酶底比較小時，血紅蛋白DH也較低。10 g/100 mL TCA溶液能夠溶解四肽以下的小肽和氨基酸，而分子質(zhì)量較大的多肽片段由于不能被溶解而形成沉淀，因此TCA可溶性氮含量是衡量水解液中小分子肽含量的重要指標(biāo)。隨著DH的增大，小分子肽含量隨之增大。酶底比增大到一定程度后DH增幅減小的原因為：一方面，在底物質(zhì)量濃度不變時，隨著酶底比的增加，可以提高底物與酶的接觸率，加快酶解反應(yīng)進(jìn)程，豬血紅蛋白被充分水解為寡肽或游離氨基酸，提高DH[30-31];另一方面，當(dāng)?shù)鞍酌赶鄬τ诘孜镞^多時，酶添加量過高導(dǎo)致酶分子間的競爭性抑制[32]，同時，隨著反應(yīng)的進(jìn)行酶解產(chǎn)物含量提高，酶解產(chǎn)物與尚未作用的酶有可能形成復(fù)合物，阻礙底物與蛋白酶的相互作用，延緩水解進(jìn)程[33]，再增加酶底比意義不大。在水解過程中，血紅蛋白水解越完全，包裹在血紅蛋白疏水性內(nèi)部的血紅素暴露越充分，在加熱酸沉?xí)r，血紅素及相連的未被水解的多肽片段沉淀越多，水解液中殘留的血紅素就越少，脫色效果就越好。因此隨著DH增大，TCA可溶性氮含量越高，血紅素殘留量就越低。在相同酶底比條件下，使用胰蛋白酶時的DH、TCA可溶性氮含量比用堿性蛋白酶時高，而血紅素殘留量比用堿性蛋白酶時低。從效費比的角度，選擇胰蛋白酶，酶底比2 500、5 000、7 500 U/g進(jìn)行正交試驗。

2.1.2 酶解溫度對豬血紅蛋白酶解脫色效果的影響

由圖2可知，胰蛋白酶和堿性蛋白酶對酶解溫度的適應(yīng)范圍較廣，在40～60 ℃均表現(xiàn)出明顯的水解能力。酶解溫度40～60 ℃，使用2 種酶時酶解液DH和TCA可溶性氮含量均先隨酶解溫度的升高顯著上升（P<0.05），血紅素殘留量先隨酶解溫度的升高顯著下降（P<0.05），然后DH和TCA可溶性氮含量又隨酶解溫度的升高而顯著下降（P<0.05），血紅素殘留量則隨酶解溫度的上升而顯著上升（P<0.05）。胰蛋白酶在酶解溫度45 ℃時的DH、TCA可溶性氮含量達(dá)到最大，顯著高于其他處理組（P<0.05），血紅素殘留量顯著低于其他處理組（P<0.05）;堿性蛋白酶在酶解溫度55 ℃時DH、TCA可溶性氮含量達(dá)到最大，顯著高于其他處理組（P<0.05），血紅素殘留量顯著低于其他處理組（P<0.05），但堿性蛋白酶在酶解溫度50 ℃和60 ℃時DH差異不顯著。在蛋白酶沒有變性失活的前提下，提高溫度會增強酶活性，加快酶促反應(yīng)，DH增大;溫度過高會造成酶變性失活，這是由于高溫破壞維持蛋白酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵，酶蛋白變性，造成酶活性降低[34-35]，血紅蛋白DH會降低，TCA可溶性氮含量減少，血紅素殘留量增加，脫色效果不佳。因此胰蛋白酶45 ℃條件下酶解脫色效果較好，堿性蛋白酶55 ℃條件下酶解脫色效果較好。對比2 種酶在其最適溫度條件下的酶解脫色效果，使用胰蛋白酶的DH、TCA可溶性氮含量比用堿性蛋白酶時高，而血紅素殘留量比用堿性蛋白酶時低。因此，考慮到酶解溫度過高會破壞蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)，選用胰蛋白酶，在酶解溫度40、45、50 ℃進(jìn)行正交試驗。

2.1.3 pH值對豬血紅蛋白酶解脫色效果的影響

由圖3可知，酶解脫色效果受pH值的影響較大，主要是因為不同的酶有不同的最適pH值，過酸或過堿都會導(dǎo)致酶活性降低甚至失活。不同pH值條件下，蛋白質(zhì)的解離狀態(tài)不同，底物與酶的接觸位點也不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物不同[36]。在pH 6.0～7.5時，胰蛋白酶酶解液DH和TCA可溶性氮含量均顯著上升（P<0.05），血紅素殘留量顯著下降（P<0.05）;在pH 7.5～8.0時，胰蛋白酶酶解液DH和TCA可溶性氮含量顯著下降（P<0.05），血紅素殘留量顯著上升（P<0.05）;pH 7.5時，胰蛋白酶酶解液DH、TCA可溶性氮含量達(dá)到最大值，顯著高于其他處理組（P<0.05），血紅素殘留量顯著低于其他處理組（P<0.05）。

pH 6.0～8.0時，堿性蛋白酶酶解液DH和TCA可溶性氮含量始終顯著上升（P<0.05），并在pH 8.0時達(dá)到最大值;血紅素殘留量顯著下降（P<0.05），在pH 8.0時達(dá)到最小;pH 8.0時，DH、TCA可溶性氮含量顯著高于其他處理組（P<0.05），血紅素殘留量顯著低于其他處理組（P<0.05）。pH值的改變會影響酶活性中心帶電基團(tuán)的電離，同時還會影響底物和輔酶的電離，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化，因而只有在特定pH值范圍內(nèi)，酶、底物和輔酶的解離狀態(tài)才最適宜它們相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶解效果達(dá)到最好。因此胰蛋白酶選擇pH 7.5為宜，堿性蛋白酶pH 8.0為宜。對比胰蛋白酶在pH 7.5及堿性蛋白酶在pH 8.0時的酶解脫色效果，胰蛋白酶酶解液的DH、TCA可溶性氮含量比用堿性蛋白酶時高，而血紅素殘留量比用堿性蛋白酶時低。因此，選用胰蛋白酶，pH 7.0、pH 7.5及pH 8.0條件下進(jìn)行正交試驗。

2.1.4 底物質(zhì)量濃度對豬血紅蛋白酶解脫色效果的影響

由圖4可知，底物質(zhì)量濃度為4～12 g/100 mL時，2 種酶解液的DH及TCA可溶性氮含量均先隨底物質(zhì)量濃度的增加而顯著增加（P<0.05），在底物質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/100 mL后，又隨底物質(zhì)量濃度的增加而顯著減?。≒<0.05）;血紅素殘留量則是先隨底物質(zhì)量濃度的增加顯著減少（P<0.05），在底物質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/100 mL后，又隨底物質(zhì)量濃度的增加而顯著增加（P<0.05）。這是由于在底物質(zhì)量濃度低于8 g/100 mL時，酶還沒有被底物完全飽和，此時適量增加底物質(zhì)量濃度，可以增加酶與底物的結(jié)合位點，酶分子與底物結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物的數(shù)量增加，從而提高酶促反應(yīng)速率，提高DH，與朱振寶等[37]采用酶解法制備核桃血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽時的變化趨勢類似。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，在所有的酶分子與底物均形成酶-底物復(fù)合物后，酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大值，底物質(zhì)量濃度過大時，會降低酶在溶液中的溶解度，使酶與底物的接觸機會減少，酶解反應(yīng)變?nèi)?，此時再增加底物質(zhì)量濃度也不會提高反應(yīng)速率，靳冬武等[38]在研究超高壓酶解酪蛋白時也發(fā)現(xiàn)了類似趨勢。此外，在實驗操作中，豬血球溶液在底物質(zhì)量濃度大于10 g/100 mL時黏稠度很大，流動性差，一方面不利于酶與底物結(jié)合，另一方面不利于解除產(chǎn)物對酶的反饋抑制，酶促反應(yīng)無法向正反應(yīng)方向推進(jìn)。由此可得出底物質(zhì)量濃度選擇8 g/100 mL為宜。在底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL條件下對比胰蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解脫色效果，使用胰蛋白酶時，酶解液DH、TCA可溶性氮含量比用堿性蛋白酶時高，而血紅素殘留量比用堿性蛋白酶時低。因此選用胰蛋白酶，底物質(zhì)量濃度4、6、8 g/100 mL進(jìn)行正交試驗。

DH是衡量蛋白中肽鍵水解程度的指標(biāo)，TCA可溶性氮是衡量蛋白水解成小分子肽的指標(biāo)，二者有一定關(guān)系，但又不完全一樣，2 個指標(biāo)與血紅蛋白的水解程度呈正相關(guān)。血紅蛋白是由4 個肌紅蛋白構(gòu)成的四級結(jié)構(gòu)，肌紅蛋白呈球狀，內(nèi)部包裹著疏水性的血紅素及疏水性肽段。血紅素在酸性溶液中溶解度極低，加熱能提高疏水相互作用，還能讓蛋白內(nèi)部肽段變性沉淀，因此用加熱酸沉的方法使血紅素及其相連的肽段在疏水相互作用下彼此聚集，形成較大顆粒，產(chǎn)生沉淀從而去除，達(dá)到脫色目的。很明顯，蛋白酶水解血紅蛋白時，水解程度越高，疏水性的血紅素及肽段暴露越充分，沉淀也就越徹底，水解液中血紅素殘留量就會越低。因此血紅素殘留量不僅是衡量脫色效果的指標(biāo)，也間接反映了血紅蛋白DH，與DH呈負(fù)相關(guān)。

從上述單因素試驗結(jié)果得出，胰蛋白酶的酶解脫色效果優(yōu)于堿性蛋白酶，這與孔卓姝等[39]用蛋白酶制備豬血紅蛋白抗氧化肽的強弱順序（胃蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶）一致，因此選擇胰蛋白酶繼續(xù)進(jìn)行正交試驗。

2.2 豬血紅蛋白酶解脫色正交試驗結(jié)果與分析

由表1極差分析可知，豬血紅蛋白酶解效果影響因素的主次順序為B>D>A>C，即酶解溫度>底物質(zhì)量濃度>酶底比>pH值，因素水平最優(yōu)組合為A3B2C2D3，即酶底比7 500 U/g、酶解溫度45 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL。根據(jù)正交試驗所得最佳因素水平組合進(jìn)行3 次驗證實驗，測得豬血紅蛋白酶解液DH為25.67%，TCA可溶性氮含量為80.05%，血紅素殘留量為18.34%。DH和TCA可溶性氮含量高于正交試驗中所有組合，而血紅素殘留量則幾乎低于正交試驗中所有組合，表明所選因素水平組合的酶解效果最好。酶解脫色后的血紅蛋白多肽粉為淡黃色、不定型固體粉末，并有特殊的肉香味，經(jīng)凱氏定氮檢測，其蛋白含量為83.17%。

2.3 豬血紅蛋白多肽分子質(zhì)量分布

按胰蛋白酶最佳水解條件制備得到豬血紅蛋白多肽后，采用高效液相色譜法測定水解物分子質(zhì)量分布范圍，結(jié)果如圖5及表2所示。

由表3可知：分子質(zhì)量大于5 000 Da的肽段（即39.0 肽以上的小肽）非常少，只占多肽總量的0.12%;分子質(zhì)量1 000～5 000 Da的肽段（即7.8～39.0 肽之間的小肽）占多肽總量的5.68%;分子質(zhì)量小于1 000 Da的肽段（即8.0 肽以下的小肽）最多，占多肽總量的94.20%，較宋思佳等[40]用復(fù)合蛋白酶酶解所得豬血紅蛋白產(chǎn)物的小分子肽多（小于1 000 Da的肽段超過72%）。由此可見，豬血紅蛋白胰蛋白酶水解物中以小肽居多。

3 結(jié) 論

比較胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解豬血紅蛋白的脫色效果，結(jié)果表明：胰蛋白酶酶解液DH及TCA可溶性氮含量更高，血紅素殘留量更低，因此有更好的酶解脫色效果;通過正交試驗得到胰蛋白酶最佳酶解條件為酶底比7 500 U/g、酶解溫度45 ℃、pH 7.5、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL，該條件下酶解液DH為25.67%，TCA可溶性氮含量為80.05%，血紅素殘留量為18.34%。

豬血紅蛋白多肽分子質(zhì)量分布檢測結(jié)果表明：分子質(zhì)量大于5 000 Da的肽段（即39.0 肽以上的小肽）占多肽總量的0.12%;分子質(zhì)量1 000～5 000 Da的肽段（即7.8～39.0 肽之間的小肽）占多肽總量的5.68%;分子質(zhì)量小于1 000 Da的肽段（即8.0 肽以下的小肽）最多，占多肽總量的94.20%。豬血紅蛋白多肽粉中TCA可溶性氮含量為80.05%的蛋白占豬血紅蛋白多肽蛋白含量的96.25%，這與分子質(zhì)量分布結(jié)果比較符合。

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