食鹽對傳統(tǒng)發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的影響

湯興宇 王浩東 吳念 黃佳卉 黃豪 田星 李宗軍

摘 要：以不同食鹽添加量（0%、1%、3%、5%、7%）發(fā)酵肉（戊糖片球菌∶木糖葡萄球菌=1∶1）為研究對象，測定發(fā)酵肉微生物菌群、pH值、水分含量、亞硝酸鹽殘留量，以及最終成熟發(fā)酵肉中食鹽、總氮、非蛋白氮及鹽溶性蛋白含量，研究食鹽添加量對發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的影響。結(jié)果表明：隨著食鹽添加量的增加，微生物菌群數(shù)量基本呈先上升后下降的趨勢;食鹽添加量3%的發(fā)酵肉，蛋白質(zhì)水解指數(shù)最高，鹽溶性蛋白含量最低，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶最為清晰。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵肉制品;食鹽添加量：微生物菌群;理化特性;鹽溶性蛋白

Abstract： To investigate the effects of salt content on the microbial flora， physicochemical properties and salt-soluble protein characteristics of traditional fermented meat made with a mixed starter culture of Pediococcus pentosaceus and Staphylococcus xylose （1：1） during fermentation， microbial populations， pH value， water content， and nitrite residue of fermented meat samples with different initial salt contents （0%， 1%， 3%， 5% and 7%） were measured as a function of fermentation time， and the contents of salt， total nitrogen， non-protein nitrogen and salt-soluble protein in the final product were determined as well. It was found that microbial populations showed a trend of rise and then decline with the increase in salt content. Fermented meat with 3% salt content exhibited the highest proteolytic index， lowest salt-soluble protein content， and clearest bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）.

Keywords： fermented meat products; salt content; microbial flora; physicochemical properties; salt-soluble protein

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200701-166

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0001-07

發(fā)酵肉制品是指在自然和人工控制條件下利用微生物發(fā)酵作用，產(chǎn)生具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地且具有較長保存期的肉制品[1-2]。隨著現(xiàn)代人們生活質(zhì)量和水平的進一步提高，對于肉制品的營養(yǎng)要求越來越高，營養(yǎng)、健康和特殊風(fēng)味相結(jié)合也成為肉制品的主要研發(fā)方向[3]。而傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品加工過程中，發(fā)酵肉中的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物作用分解為氨基酸，而氨基酸進一步分解形成大量的香味物質(zhì)和營養(yǎng)成分[4]，從而促使發(fā)酵肉產(chǎn)品產(chǎn)生獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。因此，發(fā)酵肉制品能夠很好地滿足現(xiàn)代消費者對高檔優(yōu)質(zhì)肉制品特殊風(fēng)味和營養(yǎng)的需求[5-7]。

食鹽（NaCl）是肉制品加工中不可或缺的腌制材料，不僅能賦予產(chǎn)品咸度，增加鮮度，而且對產(chǎn)品加工及品質(zhì)特性的形成具有重要貢獻。一方面，食鹽增強了肉制品的保水能力，從而促進理想凝膠質(zhì)地的形成;另一方面，食鹽可通過控制生化和酶促反應(yīng)來促進香氣和風(fēng)味的產(chǎn)生。此外，食鹽能夠降低水分活度，抑制微生物的生長繁殖[8]。事實上，肉類食品在人類飲食鈉消耗量中的占比約為20%～30%，尤其是發(fā)酵肉制品，其食鹽含量一般高于其他食品數(shù)倍，由于長時間發(fā)酵過程中水分遷移和蒸發(fā)，食鹽含量可能達到5.0%～8.0%[9]。但是，過量攝入高鹽食品會增加高血壓、中風(fēng)和血管疾病的患病風(fēng)險[10]，如何降低肉制品中的食鹽添加量已成為肉制品加工領(lǐng)域的研究熱點和全民健康的焦點之一。國內(nèi)外肉制品行業(yè)也在積極采取多種降鹽措施，但在工業(yè)化生產(chǎn)中降低肉制品中食鹽用量仍存在困難[11-13]。目前，國內(nèi)外研究主要集中于降低肉制品中鈉鹽的途徑，而從發(fā)酵成熟過程的角度出發(fā)，針對食鹽對傳統(tǒng)發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及蛋白特性變化影響的研究較少[14-16]。事實上，食鹽在發(fā)酵肉制品成熟過程中具有重要作用，添加量不同，食鹽對發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質(zhì)的影響也不盡相同。

本實驗以同一批次的新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉為原料，以戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）為發(fā)酵劑，研究不同食鹽添加量發(fā)酵肉在成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的變化，為提高發(fā)酵肉制品安全性提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉 湖南偉鴻食品有限公司;52°白酒、食鹽、味精、白糖 長沙嘉而惠超市。

戊糖片球菌由中國科學(xué)院微生物保藏中心提供;木糖葡萄球菌由本實驗室分離自傳統(tǒng)湘西臘肉。

MRS培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基? ?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、乙酸鋅、氨水、醋酸鉛、硫酸鈉、氯化鈉、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀（均為分析純） 天津市化學(xué)試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

K9860全自動凱式定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司;CP114分析天平 奧豪斯儀器有限公司;Testo 250 pH計、LabTech分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;D2S2-LJ080高壓滅菌鍋 山東新醫(yī)療器械股份有限公司;101-3HB干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;SKY-2102C搖床 上海浦東生物光學(xué)儀器廠;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;KQ-100E超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;LG10-24A高速臺式離心機 常州中捷實驗儀器制造有限公司;GZ-250-HSII恒溫恒濕箱 廣智科技設(shè)備有限公司;TG16-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;XMTD-7000水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑和發(fā)酵肉的制備

取適量已活化的戊糖片球菌和木糖葡萄球菌菌種分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基和MSA液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。

選取新鮮的無脂豬里脊肉，以每塊質(zhì)量約（200±2） g按紋理進行切分，分別添加不同質(zhì)量分數(shù)（0%、1%、3%、5%、7%）食鹽，并與其他輔料（白酒2%、白糖1.5%、味精0.3%）充分混合，常溫腌制48 h后，按照每100 g原料肉，添加1 mL菌體濃度108 CFU/g的發(fā)酵劑菌液（戊糖片球菌∶木糖葡萄球菌=1∶1），同時加入0.008%亞硝酸鈉。工藝流程如圖1所示。

1.3.2 樣品采集

在發(fā)酵0、5、10、15 d時，分別對不同食鹽添加量發(fā)酵肉取樣，每次隨機取2 塊，每塊取3 個不同點，每次至少取50 g。取樣后，各樣本取一部分直接進行微生物指標(biāo)測定，剩余部分真空包裝后于-40 ℃冷凍保存，用于其他指標(biāo)測定。

1.3.3 微生物指標(biāo)測定

取不同發(fā)酵成熟階段肉樣置于無菌超凈工作臺中，切碎，取25 g肉樣置于含有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，封口后于搖床中振蕩40 min，取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，對上清液進行梯度稀釋，分別稀釋至10-3、10-4、10-5，每個稀釋度做3 個平行。細菌菌落總數(shù)計數(shù)采用PCA平板計數(shù)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h;葡萄球菌計數(shù)采用MSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h;乳酸菌計數(shù)采用MRS培養(yǎng)基（含100 mg/L放線菌酮），37 ℃培養(yǎng)48 h;腸桿菌計數(shù)采用結(jié)晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h;酵母菌計數(shù)采用馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h;每個實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 理化指標(biāo)測定

1.3.4.1 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[17]中的玻璃電極法。

1.3.4.2 水分含量

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[18]，采用直接干燥法進行測定。稱取4 g攪碎肉樣置于已烘干至恒質(zhì)量的稱量瓶中（前后2 次質(zhì)量差不超過2 mg即為恒質(zhì)量），105 ℃烘干至樣品恒質(zhì)量。每個樣品做3 次平行。

1.3.4.3 亞硝酸鈉殘留量

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[19]的鹽酸萘乙二胺法。

1.3.4.4 食鹽含量

參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食鹽指標(biāo)的測定》[20]中的間接滴定法。

1.3.5 蛋白質(zhì)水解情況測定

1.3.5.1 總氮（total nitrogen，TN）和非蛋白氮（non protein nitrogen，NPN）含量TN含量：參照張會麗等[21]的方法，稱取0.5 g肉樣，放入消化管內(nèi)，加入10 mL濃硫酸（體積分數(shù)98%）和由0.2 g硫酸銅和3 g硫酸鉀組成的混合催化劑，在380 ℃條件下消化2 h，冷卻至室溫后用凱氏定氮儀進行測定。

NPN含量：參照吳雪燕等[22]的方法，稱取（1.000±0.001）g肉樣，加入15 mL預(yù)冷的10 g/100 mL三氯乙酸溶液，5 000 r/min勻漿1 min，4 ℃放置過夜。將勻漿液以4 500 r/min離心5 min，棄去沉淀，上清液用定性濾紙過濾到消化管中，按照TN含量測定過程相同步驟進行消化，冷卻至室溫后，用凱氏定氮儀進行測定。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)水解指數(shù)

按下式計算：

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析鹽溶性蛋白質(zhì)的提取：準(zhǔn)確稱?。?.000±0.001） g肉樣于50 mL離心管中，加入16 mL 0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl和0.03 mol/L MgCl2），5 000 r/min勻漿2 min，每30 s暫停1 次防止過熱，4 ℃靜置18 h后，再于10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，即為鹽溶性蛋白質(zhì)溶液，立即使用或置于-40 ℃條件下冷凍備用。用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度。

將上述鹽溶性蛋白質(zhì)提取液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，等質(zhì)量等體積與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，10 000 r/min離心2 min，取上清液待測。按照試劑盒說明配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量10 μL，120 V恒壓電泳20 min后，150 V恒壓電泳至終點。用考馬斯亮藍R250染色1 h，脫色至背景無色，掃描圖譜并分析條帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)測定均重復(fù)進行3 次。用SPSS 25.0軟件采用方差分析進行顯著性差異分析，P<0.05表示差異顯著;用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中不同食鹽添加量發(fā)酵肉的微生物指標(biāo)變化

2.1.1 細菌菌落總數(shù)

由圖2可知，發(fā)酵期間隨著發(fā)酵時間的延長，不同食鹽添加量發(fā)酵肉的細菌菌落總數(shù)均呈波動降低的趨勢，食鹽添加量0%～5%發(fā)酵肉的細菌菌落總數(shù)在發(fā)酵10 d時達到最高，食鹽添加量7%發(fā)酵肉在發(fā)酵15 d時達到最高。這可能是由于發(fā)酵前期微生物作用使蛋白質(zhì)降解，為細菌生長繁殖提供了充足營養(yǎng)，而發(fā)酵后期水分含量降低，氯化鈉質(zhì)量濃度上升，營養(yǎng)物質(zhì)含量也減少，細菌生長速率受到抑制，細菌數(shù)量逐漸減少。此外，在腌制過程中加入食鹽也能夠有效抑制雜菌的生長，并加速發(fā)酵進程[23]，因此，隨著腌制過程中食鹽添加量的增大，發(fā)酵肉中的細菌總數(shù)呈現(xiàn)一定波動性。

2.1.2 葡萄球菌數(shù)

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，不同食鹽添加量發(fā)酵肉葡萄球菌數(shù)整體呈先升高后下降的趨勢，發(fā)酵5～15 d期間，食鹽添加量3%發(fā)酵肉的葡萄球菌數(shù)顯著低于其余4 組（P<0.05），其原因可能是與乳酸菌相比，3%的食鹽添加量對葡萄球菌的抑制作用更強，同時乳酸菌產(chǎn)生的乳酸降低pH值，使葡萄球菌數(shù)量進一步降低。

2.1.3 腸桿菌數(shù)

由圖4可知，不同食鹽添加量發(fā)酵肉的腸桿菌數(shù)隨著發(fā)酵時間的延長整體呈下降趨勢。整個發(fā)酵期間，食鹽添加量0%與1%發(fā)酵肉的腸桿菌數(shù)（除發(fā)酵5 d）差異不顯著，當(dāng)食鹽添加量增大至3%～7%時，發(fā)酵肉腸桿菌數(shù)量明顯降低，由此可見，高食鹽添加量對于發(fā)酵肉中大腸桿菌有明顯的抑制作用。

2.1.4 乳酸菌數(shù)

由圖5可知：腌制時加入的食鹽、發(fā)酵劑在一定程度上抑制乳酸菌的生長，隨著發(fā)酵時間的延長耐受性逐漸增強，乳酸菌數(shù)緩慢上升;發(fā)酵期間隨著食鹽添加量的增加乳酸菌數(shù)先增加后降低，但發(fā)酵15 d時食鹽添加量3%發(fā)酵肉中的乳酸菌數(shù)最低;發(fā)酵期間食鹽添加量1%發(fā)酵肉的乳酸菌數(shù)始終高于其他食鹽添加量的發(fā)酵肉，由此可知，1%的食鹽添加量較為適合乳酸菌的生長。發(fā)酵肉成熟過程中，乳酸菌一直處于優(yōu)勢地位，從而抑制腐敗菌和致病菌的生長[24]。

2.1.5 酵母菌數(shù)

酵母菌作為兼性好氧菌，能夠消耗發(fā)酵肉中的氧氣，并且產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶，使肉制品產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[25]。由圖6可知，不同食鹽添加量發(fā)酵肉中的酵母菌數(shù)均在發(fā)酵前期（0～5 d）急劇增長，發(fā)酵后期（10～15 d）快速下降，但始終高于初始酵母菌數(shù)。酵母菌有較強的抗逆能力，可抵抗低水分活度，且耐酸、耐厭氧。

2.2 發(fā)酵過程中不同食鹽添加量發(fā)酵肉理化指標(biāo)的變化

2.2.1 水分含量和pH值

由圖7可知：發(fā)酵初期（0～5 d），隨著食鹽添加量增加，發(fā)酵肉中的水分含量逐漸減少，這是由于食鹽不僅能增強滲透壓，并且隨食鹽添加量增加，Na+遷移速率增大，促使發(fā)酵肉脫水[25]，而且還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水力下降;發(fā)酵后期（10～15 d），由于高添加量的食鹽抑制了微生物生長，減緩了發(fā)酵肉中水分含量的下降。

成熟過程中pH值的變化影響發(fā)酵肉中水解酶的活性，從而影響蛋白和脂質(zhì)水解進程，揮發(fā)性風(fēng)味成分的釋放，并影響最終發(fā)酵肉的品質(zhì)[26]。較低pH值會抑制肉中蛋白質(zhì)水解酶的活性，并改變最終產(chǎn)品的風(fēng)味。由圖8可知，發(fā)酵初期（0～5 d），3%食鹽添加量的發(fā)酵肉pH值最低，這可能是由于食鹽添加量適中，微生物大量繁殖分解肉中碳水化合物導(dǎo)致酸類物質(zhì)增多。而發(fā)酵后期，微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的胺類物質(zhì)積累導(dǎo)致pH值升高。

2.2.2 食鹽含量

由圖9可知，隨著食鹽添加量的增加，發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的食鹽含量逐漸增加，并且相比腌制時均略有上升。食鹽添加量3%和5%發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的食鹽含量接近，可能是由于5%食鹽添加量的發(fā)酵肉中，部分Na+被細胞吸收，細胞發(fā)生脫水，但細胞膜仍具有生理活性，進一步提高食鹽添加量，肌肉細胞脫水死亡，細胞液外泄，使終產(chǎn)品中的食鹽含量增大。

2.2.3 亞硝酸鹽殘留量

本實驗發(fā)酵肉腌制時的亞硝酸鹽添加量為0.008%，由圖10可知，發(fā)酵0 d，亞硝酸鹽殘留量均低于80 mg/kg，這可能是腌制階段亞硝酸鹽與肉樣中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致含量降低[27]。發(fā)酵初期（0～5 d），食鹽添加量0%、1%和5%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量顯著降低（P<0.05），食鹽添加量7%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量顯著升高（P<0.05），這是因為在發(fā)酵初期，亞硝酸鹽主要起到發(fā)色和抑菌作用。發(fā)酵后期（10～15 d），亞硝酸鹽殘留量明顯降低。整個發(fā)酵期間，食鹽添加量3%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量變化不大。

2.3 不同食鹽添加量發(fā)酵肉終產(chǎn)品的蛋白質(zhì)水解相關(guān)指標(biāo)變化

蛋白質(zhì)水解是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品加工過程中重要的生化反應(yīng)，而蛋白質(zhì)水解指數(shù)可以反映蛋白質(zhì)的水解程度以及風(fēng)干過程中蛋白質(zhì)分解的宏觀進程[28]。由表1可知，隨著食鹽添加量的增加，發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的TN含量逐漸降低，蛋白質(zhì)水解指數(shù)基本維持不變，其中3%～5%食鹽添加量的發(fā)酵肉蛋白質(zhì)水解程度最高。

2.4 不同食鹽添加量發(fā)酵肉終產(chǎn)品的鹽溶性蛋白特性

由圖11可知，隨著食鹽添加量的增加，發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的鹽溶性蛋白含量呈先減少后增加再減少的趨勢。研究表明，蛋白質(zhì)溶出量與其鹽溶性存在函數(shù)關(guān)系，食鹽是影響鹽溶性蛋白提取的重要因素[29-30]。本研究中，食鹽添加量3%時鹽溶性蛋白流失最快，導(dǎo)致其終產(chǎn)品中的鹽溶性蛋白含量最少。

由圖12可知，鹽溶性蛋白質(zhì)分子主要集中在20～66 kDa，添加食鹽后條帶顏色加深，食鹽添加量3%時條帶最為清晰，表明其所含目標(biāo)蛋白（結(jié)蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白以及輕鏈Ⅰ）最多。這可能是因為3%食鹽添加量較為適合發(fā)酵肉中微生物生長，此外，鹽溶性蛋白含量的減少與pH值變化有關(guān)，酸堿環(huán)境的改變會導(dǎo)致鹽溶性蛋白聚集，蛋白變性成不溶性蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取液中溶出量減少。

3 結(jié) 論

發(fā)酵肉成熟過程中，隨著食鹽添加量的增加，發(fā)酵肉微生物菌群數(shù)基本呈先上升后下降的趨勢。食鹽添加量對發(fā)酵肉的pH值、亞硝酸鈉殘留量等指標(biāo)有重要影響，蛋白質(zhì)水解指數(shù)基本維持不變，其中3%食鹽添加量發(fā)酵肉的蛋白質(zhì)水解指數(shù)最高、鹽溶性蛋白含量最低、SDS-PAGE電泳條帶最為清晰。從健康方面考慮，3%食鹽添加量的發(fā)酵肉，其鹽含量適中，明顯低于市場銷售的5%～8%食鹽含量的高鹽發(fā)酵肉制品，這說明在保證發(fā)酵肉風(fēng)味和營養(yǎng)的同時，可以適當(dāng)控制和減少食鹽添加量，從而確定最佳的發(fā)酵肉制品加工配方。如何生產(chǎn)出高品質(zhì)、營養(yǎng)健康的功能性發(fā)酵肉制品將成為肉制品加工行業(yè)的新熱點。

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