中華鱉暗溫室養(yǎng)殖水體理化因子及微生物多樣性分析

常曉 張菊 張艷芹 閆保國 管越強

摘 要：暗溫室是中華鱉（Pelodiscus sinensis）人工養(yǎng)殖的主要方式之一。為闡明中華鱉暗溫室養(yǎng)殖過程中高氮水體和低氮水體中微生物多樣性及其與環(huán)境因子的關系，在河北省鹿泉中華鱉暗溫室養(yǎng)殖池挑選了總氮濃度較高的池塘和總氮濃度較低的池塘進行了水體理化因子監(jiān)測和微生物多樣性對比分析。水體理化因子檢測結果顯示兩種水體的溫度均在30 ℃左右，pH值為7左右，符合中華鱉的養(yǎng)殖要求。兩種水體的溶解氧為0.25 mg/L左右。高氮水體的總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的濃度相較于低氮水體均比較高。高氮與低氮水體在各分類水平上的優(yōu)勢菌群均存在差異，低氮水體綠屈擾菌門（Chloroflexi）占據(jù)主要優(yōu)勢，而高氮水體中變形菌門（Proteobacteria）占主要優(yōu)勢，屬水平層次上低氮水體中的優(yōu)勢菌為束縛桿菌屬（Haliscomenobacter）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）。高氮水體多核桿菌屬（Polynucleobacter）、亮桿菌屬（Leucobacter）占據(jù)優(yōu)勢地位，兩種水體物種豐富度及相似度存在差異。結果表明高氮與低氮水體不僅在總氮和無機氮濃度上差別較大，微生物多樣性也存在明顯差距，微生物區(qū)系不同可能是造成氮濃度差異的原因之一。

關鍵詞：中華鱉（Pelodiscus sinensis）;微生物多樣性;暗溫室養(yǎng)殖;理化因子;環(huán)境調(diào)控

中華鱉口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及微量元素，是一種高蛋白低脂肪的食物原料，長期以來一直被視為珍品，市場需求高漲[1]。中華鱉現(xiàn)有養(yǎng)殖模式主要有日光棚集約化養(yǎng)殖、暗溫室高密度養(yǎng)殖、日光棚+暗溫室兩段式養(yǎng)殖、仿生態(tài)養(yǎng)殖等[2]。高密度的暗溫室養(yǎng)殖養(yǎng)殖密度大、產(chǎn)量高，優(yōu)點是光線較弱，中華鱉互相撕咬現(xiàn)象明顯減少，缺點是水體中殘餌和糞便積累，養(yǎng)殖水體污染嚴重，患病幾率增加。本實驗通過對河北省鹿泉中華鱉暗溫室高氮和低氮養(yǎng)殖水體進行水質(zhì)理化參數(shù)監(jiān)測和微生物多樣性分析，闡明水體環(huán)境參數(shù)和微生物區(qū)系組成，為改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)特別是減少氮源污染，實現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

分別取中華鱉良種場暗溫室兩個池塘養(yǎng)殖水體樣品，總氮濃度較高的養(yǎng)殖池塘，記為H-N，總氮濃度較低的養(yǎng)殖池塘，記為L-N。分別在兩個池塘的左、中、右位置取水，每個池塘取3個水樣，用于水質(zhì)監(jiān)測和微生物多樣性分析。

1.2 水體理化因子分析

現(xiàn)場采樣過程中，采用YSI pH100A便攜式酸度計測定pH值，采用YSI DO200便攜式溶氧儀測定溶解氧濃度。水樣帶回實驗室測定總氮、氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等化學指標。總氮采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法進行測定，氨氮采用納氏試劑-分光光度法進行測定，亞硝酸鹽采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法進行測定，硝酸鹽采用紫外分光光度法進行測定[3]。

1.3 水體微生物多樣性分析

1.3.1 樣品處理 過濾前靜置分離懸浮顆粒，用20 μm大孔徑濾膜預過濾一遍，再用0.22 μm微孔濾膜進行抽濾，水樣過濾之后，將微生物富集的濾膜裝在50 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 DNA提取、PCR和高通量測序 水體微生物多樣性由上海派森諾生物科技股份有限公司進行測定。提取總DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計對DNA進行濃度和質(zhì)量檢測，設計簡并引物：520F：5-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3， 802R： 5-TACNVGGGTATCTAATCC-3擴增細菌16S rRNA V4區(qū) （C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N） 。PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并進行磁珠純化回收?；厥债a(chǎn)物采用酶標儀Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）測定濃度，所用試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)測定的濃度，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，最后上機進行高通量測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)的篩查與處理 運用QIIME 2軟件切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列。隨后，通過QIIME 2軟件調(diào)用DADA2進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體序列獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

1.3.4 物種分類學注釋 對于細菌或古菌的16S rRNA基因，默認選用Greengenes數(shù)據(jù)庫。對于每個ASVs的特征序列或每個OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認參數(shù)，使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進物種注釋。

1.3.5 α-多樣性分析 多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度（richness）、多樣性（diversity）和均勻度（evenness）等方面的指標[4]，也被稱為生境內(nèi)多樣性，反映的是單個樣品中的物種多樣性。采用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson diversity index）、Chao1指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)（Pielou evenness index）和覆蓋率（Coverage）對6個樣品中微生物的α-多樣性進行比較和分析[5]。樣品中的群落多樣性用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)[6]和辛普森指數(shù)估算，樣品中的物種總數(shù)（OTU數(shù)目的指數(shù)）用Chao1[7]算法估計，樣品中群落的均勻度用Pielou均勻度指數(shù)估算，用樣品文庫的覆蓋率[8]評價測序結果的真實性。

1.3.5 物種差異分析及標志物種 為了探究微生物群落組成上的差異（即β-多樣性），了解微生物群的差異主要是由哪些物種的差異分布所導致的，借助ASV/OTU維恩圖、物種組成熱圖、LEfSe分析等方法來進行分析，進一步展示樣品間的物種差異。

2 結果與分析

2.1 水體理化因子檢測結果

水體的現(xiàn)場水質(zhì)監(jiān)測結果顯示，低氮水體溫度為30.0 ℃，pH值為7，溶解氧為0.25 mg/L，高氮水體溫度為30.1 ℃，pH值為7，溶解氧為024 mg/L。實驗室檢測結果顯示高氮水體總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的濃度均高于低氮水體（表1）。

2.2 微生物多樣性檢測結果

2.2.1 物種分類學注釋 通過與數(shù)據(jù)庫Greengenes比對，進行物種注釋，可得到分類學注釋結果統(tǒng)計表（表2）并對不同分類層級統(tǒng)計，分別對應各樣本中能分類至界、門、綱、目、科、屬、種的OTU數(shù)。發(fā)現(xiàn)低氮養(yǎng)殖池中LN-1只能分類到界的OTU數(shù)為11個，分類到門的OTU數(shù)為4個，分類到綱水平上的OTU數(shù)為55個，以此類推。

2.2.2 物種組成分析 將每個注釋上的物種歸類于不同的分類水平，并將OTU在不同樣品中的序列數(shù)進行整理分析，不同樣本在各分類水平所含有的分類單元的數(shù)目（表3）。LN-1樣本包含有22個門、43個綱、90個目、125個科、161個屬和47個種，以此類推。

根據(jù)物種組成結果分析，可得到各樣本在門、綱、目、科、屬水平上最大豐度排名前二十的物種，生成物種組成柱狀圖（圖1，見封三）。以便直觀查看各樣本在不同分類水平上，相對豐度較高的物種及其比例（表4）。2.2.3 α-多樣性分析

樣品的覆蓋度（Coverage）相同，均為0.99，說明測定結果能夠代表樣品的真實情況。低氮水體中香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Weiner Index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）相較于高氮池較高，即低氮池中的細菌群落多樣性更為豐富。高氮水體的均勻度指數(shù)（Pielou index）比低氮水體高，說明高氮水體群落中個體分配上的均勻性比低氮水體高。低氮水體的Chao1指數(shù)相較于高氮水體較高，說明低氮水體細菌群落豐富度較高（表5）。2.2.4 水體菌群差異分析 為了進一步分析樣品間菌群群落復雜度的差異，分別做主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）和 UPGMA 聚類樹分析（如圖2和圖3）。由主坐標分析可以看出代表低氮和高氮養(yǎng)殖水體平行樣品的三個點距離相近而兩組樣品間距離較遠，說明低氮池和高氮池中平行樣品間的群落組成相似，而低氮和高氮養(yǎng)殖池間群落組成差異較大。UPGMA 聚類樹分支長度越短代表兩樣品越相似，低氮和高氮養(yǎng)殖池三個平行樣品之間的相似度較高，而兩個養(yǎng)殖池間的群落差異較大。

2.2.5 基于OTUs的維恩圖分析 為了解不同的樣本組間有哪些物種是共有的，哪些是獨有的，分析不同樣本之間共有、特有的OTUs得到以下維恩圖（圖4）?？梢钥闯龅偷靥赜械? 776個OTUs，高氮池特有1 240個OTUs，低氮池和高氮池共有296個OTUs，表明低氮養(yǎng)殖池的物種豐富程度高，并且低氮養(yǎng)殖池與高氮養(yǎng)殖池的物種差異較大。2.2.6 物種組成熱圖 為了比較樣本間的物種組成差異，實現(xiàn)對各樣本的物種豐度分布趨勢的了解，使用屬水平的分類單元組成作為分析對象，使用平均豐度前20位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖（圖5，見封三）。紅色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本高，藍色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本低。結果顯示在屬水平上，高氮水體與低氮水體的前20位物種豐度差異較大。透明球菌屬（Perlucidibaca）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、纖毛菌屬（Leptothrix）等在低氮養(yǎng)殖池豐度較高，而在高氮養(yǎng)殖池豐度較低。亮桿菌屬（Leucobacter）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、多核桿菌屬（Polynucleobacter）等在高氮養(yǎng)殖水體中豐度較高。高氮與低氮兩種養(yǎng)殖水體的氮濃度存在差異可能與水體中某些微生物特別是具有硝化反硝化功能的微生物的豐度相關。

2.2.7 LEfSe分析 為了尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種，即標志物種（biomarker），采用LEfSe （LDA Effect Size）進行分析，生成組間豐度柱狀圖（圖6），用以展示標志物種在不同分組樣品中的具體分布情況。亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、Ellin6067、mle1_7均屬于亞硝化單胞菌科，并且都只在低氮池中有分布，在高氮養(yǎng)殖池中均未發(fā)現(xiàn)存在。芽孢桿菌屬（Bacillus）在低氮池中的豐度比在高氮池的豐度高。氣單胞菌屬（Aeromonas）在高氮池中的豐度比在低氮池中的豐度高，檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）只在高氮池中有分布，在低氮池中未發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在。

2.2.8 菌群謝功能預測 PICRUSt能將16S rRNA基因序列在KEGG功能譜數(shù)據(jù)庫中進行預測。代謝水平的結果（圖7）所示6個分組，包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細胞進程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類疾病（Human Diseases），每一類代謝通路又被進一步劃分為多個等級。所有樣品的平均豐度以新陳代謝（Metabolism）所集聚的菌群數(shù)量最多，而在該等級中又以碳水化合物（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）的菌群為主，說明養(yǎng)殖池內(nèi)有比較多的微生物參與分解了養(yǎng)殖水體中的糖類、有機氮等物質(zhì)。

2.2.9 代謝通路差異分析 為了找出組間具有顯著差異的代謝通路，構建組間差異代謝通路圖。PWY-7084代謝通路在低氮池與高氮池兩個分組中具有顯著差異（P<0.001）。PWY-7084代謝通路為硝化與反硝化過程（圖8），在兩個養(yǎng)殖池中亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）對硝化與反硝化過程的貢獻最大，而縱坐標為代謝通路的相對豐度，在低氮池的中亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）豐富度高于高氮池，硝化與反硝化過程主要發(fā)生在低氮池。3 討論

采用擴增子高通量測序方法對暗溫室中的高氮和低氮兩種養(yǎng)殖水體細菌多樣性進行了分析，并對水質(zhì)理化參數(shù)進行監(jiān)測。經(jīng)調(diào)查，低氮池患病率明顯低于高氮池，而產(chǎn)量高于高氮池。兩種養(yǎng)殖水溫較為恒定，均在30 ℃左右，pH 值為7左右，溶解氧僅為0.25 mg/L左右，高氮池中的各個含氮指標均相對較高，氮含量較高是高氮池內(nèi)水體污染嚴重的重要體現(xiàn)，水中殘餌以及代謝廢物無法分解，導致養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度不斷升高，養(yǎng)殖水體的水質(zhì)嚴重惡化[9]，進而影響中華鱉進行正常的代謝活動，致使患病幾率增加。雖然低氮水體的氮濃度指標相較于高氮池低，但與中華鱉溫室養(yǎng)殖正常水質(zhì)[10-11]相比仍偏高，推測是養(yǎng)殖密度大、換水率和頻次偏低，導致有機物積累過多，由于好氧微生物需消耗大量的溶解氧，導致水中供氧不足，影響了氨氮氧化為亞硝態(tài)氮，進而氧化為硝態(tài)氮的需氧反應過程。

低氮養(yǎng)殖池與高氮養(yǎng)殖池相比在微生物多樣性上存在差異，高氮池的微生物種數(shù)低于低氮池。暗溫室透氣性差且溫度高，高蛋白飼料殘余不能降解造成養(yǎng)殖水體發(fā)黑有臭味[12]，水體中富含有機氮和糖類，結果顯示在低氮池中存在一些微生物起到降解有機氮和糖類的作用，進而起到降低水體含氮量和富營養(yǎng)化的作用。低氮池Chao1、香農(nóng)威納指數(shù)和辛普森指數(shù)均較高，說明低氮水體細菌群落豐富度較高，且微生物生物多樣性也較高。

龜鱉傳染病中危害最大的是紅（白）底板病、腸炎病、白斑病、腐皮病、肺出血、疥瘡病等細菌性傳染病[13]。目前已經(jīng)從患病中華鱉體內(nèi)分離出致病菌有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、普通變形桿菌（proteus vulgaris）等。在高氮池中發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬（Aeromonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在且豐度較高，在低氮池中未檢測到檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在，氣單胞菌屬（Aeromonas）的豐度也比高氮池中低。推測高氮池中的中華鱉患病率高可能與其水體中的條件致病菌豐度較高密切相關。

養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大和養(yǎng)殖密度的增加，導致溶氧含量少，進而導致氨態(tài)氮無法轉(zhuǎn)化，水體氮含量不斷積累，造成水體嚴重惡化[14-15]。而微生物防治以其成本低，無再污染的優(yōu)點應用甚廣[16]。據(jù)國內(nèi)外研究報道，在土壤、海底污泥、養(yǎng)殖池塘中通過分離和培養(yǎng)可得到具有硝化作用、反硝化作用以及同步硝化與反硝化過程的菌株，被應用于污水中，降氮效果明顯[17-19]。越來越多具有降氮效果的細菌從環(huán)境中分離出來，李泳洪[20]等人分離出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌降氮效果明顯，該菌屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。芽孢桿菌屬（Bacillus）在低氮池中豐度較高，而在高氮池中豐度較低。亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）與硝化與反硝化過程密切相關，該屬在低氮池中豐度較高，在高氮池中未發(fā)現(xiàn)其存在。推測低氮養(yǎng)殖池的氮含量相較于高氮養(yǎng)殖池較低是由于水體中具有降氮效果的細菌。養(yǎng)殖生產(chǎn)中可投放具有降解氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的菌株，在暗溫室養(yǎng)殖水體里可減少氮源污染，達到凈化水質(zhì)的作用，實現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖。

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Physico-chemical factors and microbial diversity analysis of water body in Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis dark greenhouse culture

CHANG Xiao1，ZHANG Ju1，ZHANG Yanqin1，YAN Baoguo2，GUAN Yueqiang1

（1.College of life sciences，Hebei University，Baoding 071002，China;2.Shijiazhuang Fisheries Technology Promotion Station，Shijiazhuang 050091，China）

Abstract：Dark greenhouse farming is one of the main methods of culture of Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis. In order to clarify physico-chemical index and the microbial diversity of aquaculture water， the water body of the high nitrogen （H-N） and lower nitrogen pond （L-N） in the dark greenhouse turtle farm in Luquan， Hebei Province were sampled， and the physic-chemical factors and microbial diversity of the water body was analyzed. The results showed that the temperature of the water was about 30? ℃ and pH value was about 7， which met the requirements of the turtle culture. The dissolved oxygen of the two kinds of aquaculture water was about 0.25 mg/L. The concentrations of total nitrogen and inorganic nitrogen in H-N water were higher than those in L-N water. In term of microbial diversity， the dominant flora between H-N and L-N water were differences at different taxons. At the phylum level， Chloroflexi was dominant in L-N water， while Proteobacteria was dominant in H-N water. At the genus level， the dominant genus in L-N water were Haliscomenobacter and Nitrosomonas，while Polynucleobacterium and Leucobacter were dominant in H-N water. There were differences in species richness and similarity between the two kinds of water. The results showed that the difference of total nitrogen and inorganic nitrogen concentration was significant between H-N and L-N water， and there was also a significant difference in microbial diversity. The different microbial flora might be one of the reason of the difference of nitrogen concentration in these two kinds of ponds.

Key words：Chinese soft-shelled turtle（Pelodiscus sinensis）;microbial diversity;dark greenhouse farming;physico-chemical factors;environmental modulation

（收稿日期：2020-12-04）