分子生物學(xué)技術(shù)在飼料微生物檢測中的優(yōu)勢

胡靖宜，王忠艷

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

1 微生物檢測意義

近年來，飼料安全問題頻發(fā)，引起廣泛關(guān)注，飼料安全問題一般由致病菌引起。隨著社會(huì)的高速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)成果顯示強(qiáng)大優(yōu)勢。人工模擬酶、催化劑，領(lǐng)導(dǎo)化學(xué)工業(yè)新革命。此外，分子生物學(xué)技術(shù)可應(yīng)用到化學(xué)方面及飼料的微生物檢測，能夠保證飼料安全和人類健康。

通常情況下，在飼料的生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸過程中極易被微生物感染。通常在飼料中加入防腐劑、防霉劑，但保鮮效果不明顯。飼料一旦受到微生物污染營養(yǎng)價(jià)值就會(huì)降低，動(dòng)物在食用霉變飼料后，易生病或死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。

飼料安全問題備受關(guān)注，飼料檢測技術(shù)也日漸完善，飼料中不允許存在危害動(dòng)物健康的細(xì)菌、真菌等。為了快速高效地檢測飼料中微生物的含量各國家的重大戰(zhàn)略問題[1]。

2 微生物檢測傳統(tǒng)方法

研究顯示，傳統(tǒng)方法培養(yǎng)微生物種類較少，約為環(huán)境中微生物含量1%，無法準(zhǔn)確檢測飼料中微生物種類和數(shù)量。

目前，國內(nèi)對飼料微生物檢測傳統(tǒng)方法有平板涂布法、血球記數(shù)板直接記數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等[2]。傳統(tǒng)微生物檢測方法在飼料的微生物檢測中存在以下幾點(diǎn)不足：

（1）準(zhǔn)確性低：檢測飼料中微生物數(shù)量準(zhǔn)確性不高，且種類有限；

（2）檢測時(shí)間長：由于樣品需要培養(yǎng)，通常需要數(shù)小時(shí)甚至幾天的檢測時(shí)間；

（3）易污染：傳統(tǒng)檢測方法需要樣品培養(yǎng)，流程相對復(fù)雜，對樣品的處理過程中易造成污染。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢測領(lǐng)域顯示優(yōu)勢，具有特異性強(qiáng)、速度快、無需樣品培養(yǎng)、污染小、精度高、檢測范圍廣以及試劑耗材相對較少且成本低的優(yōu)點(diǎn)[3]。

3 飼料中微生物檢測

我國飼料微生物檢測細(xì)菌主要是大腸桿菌、霉菌及沙門氏菌。

大腸桿菌是糞便污染的指示菌，顯示飼料是否存在糞便污染。動(dòng)物一旦食用被大腸桿菌污染飼料后，損傷腸道上皮細(xì)胞，且產(chǎn)生某種腸毒素。

霉菌是主要危害飼料微生物群，我國因飼料霉變而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大。飼料被霉菌污染后會(huì)降低其營養(yǎng)價(jià)值，動(dòng)物食用后免疫系統(tǒng)受到干擾，影響動(dòng)物正常生長發(fā)育。沙門氏菌能夠感染多種動(dòng)物宿主，具有侵襲性，大部分動(dòng)物感染沙門氏菌后，容易引起動(dòng)物傷寒、副傷寒及急性胃炎發(fā)生，排出黏性血便和水樣便。

相比傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)技術(shù)作為一種新型的檢測技術(shù)，以分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，以基因序列多樣性為檢測原理，通過識別并標(biāo)記飼料中相應(yīng)分子，達(dá)到檢測飼料中微生物種類和含量目的。在飼料的微生物檢測中，主要采用PCR技術(shù)、基因探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)。因飼料檢驗(yàn)工作范圍大，分子生物學(xué)技術(shù)可高效、精準(zhǔn)檢測飼料中微生物的種類和含量，所以，可將該技術(shù)應(yīng)用于飼料的微生物檢測。

4 分子生物學(xué)技術(shù)主要檢測手段

4.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)具有較強(qiáng)特異性和靈敏度、檢測速度快、準(zhǔn)確性高。廣泛應(yīng)用在食品微生物檢測各領(lǐng)域，逐步用于飼料微生物檢測。PCR技術(shù)是以一段DNA 作為模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物共同參與下，大量擴(kuò)增該段DNA，檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行分析。在飼料微生物檢測中，通過聚合酶反應(yīng)，能夠檢測飼料微生物病原，得到飼料中致病菌含量。PCR技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠快速得出檢驗(yàn)結(jié)果。

沙門氏菌是一種人畜常見的食源性致病菌，對動(dòng)物危害很大。飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，飼料中不可以存在沙門氏菌。目前，沙門氏菌檢測方法是前增菌、增菌、分離等步驟。操作復(fù)雜且耗時(shí)較長，無法滿足發(fā)展需要。GB/T 28642-2012《飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》于2012年第17 號發(fā)布，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飼料中沙門氏菌快速檢測的方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法，并于2012年11月起正式實(shí)施。這表明PCR技術(shù)將廣泛應(yīng)用于沙門氏菌檢測。

隨著研究不斷深入，將在飼料沙門氏菌及其他致病菌的檢測中得到更多的應(yīng)用[4-10]。

4.2 基因探針技術(shù)

該方法又被稱為核酸分子雜交法，為DNA 分析奠定良好基礎(chǔ), 并得到相關(guān)領(lǐng)域認(rèn)可?；蛱结樇夹g(shù)利用互補(bǔ)基因的特異性，能夠識別特異堿基序列中一段單鏈DNA 或者RNA 分子，然后再與靶細(xì)胞雜交，對雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測，即可得到微生物含量。能夠快速靈敏地檢測到致病性微生物。工作人員對病原體進(jìn)行分離或標(biāo)記，制作探針，任何病原體都有核酸片段，利用有標(biāo)記探針可進(jìn)行雜交工作，如樣品中有特定病原體，要明確病原體中特定性，結(jié)合探針與核酸序列[5]，通過特殊方法測定標(biāo)記物。

基因探針技術(shù)不但可以檢測特異RNA，還可以檢測任意一種微生物。由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢獲得了學(xué)術(shù)領(lǐng)域的認(rèn)可，但基因探針技術(shù)仍然存在一定的不足，成本較高，操作也比較繁瑣，還會(huì)對人體產(chǎn)生一定的危害，限制基因探針技術(shù)的發(fā)展。所以，需要進(jìn)一步優(yōu)化非放射性標(biāo)記探針，將探針信號放大，研究簡單的雜交形式，使該方法更加簡單、便捷[6]。

4.3 基因芯片技術(shù)

目前，微生物檢測較為常見的技術(shù)就是基因芯片技術(shù)，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用原理是雜交測序，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法。用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，通過分析熒光分布確定檢測樣品中的特定微生物，有助于分析總結(jié)有害微生物的特征[11]?；蛐酒軌蛲瑫r(shí)分析數(shù)萬個(gè)基因，進(jìn)行高通量篩選與檢測分析，解決傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測目的分子數(shù)量少等不足。

在對飼料中微生物檢測的過程中，主要通過對微生物檢驗(yàn)中的基因序列識別，發(fā)現(xiàn)基因識別中存在問題并進(jìn)行標(biāo)記，通過序列變化識別飼料中微生物種類及含量。也可以通過基因序列變化判斷是否存在微生物超標(biāo)，檢測控制飼料中微生物含量，保障飼料的安全[12]。

5 結(jié) 語

由此可見，分子生物學(xué)技術(shù)在飼料微生物的檢測中具有明顯的優(yōu)勢，通過分子生物學(xué)高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高飼料中微生物檢測效率進(jìn)而改善飼料質(zhì)量，提高飼料的安全性。

對飼料中微生物檢測的同時(shí)，還應(yīng)將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用細(xì)化，用不同技術(shù)檢測不同微生物種類，完善分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。