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    238例皰疹性咽峽炎病原學(xué)特點分析

    2020-12-27 11:50:26冉紹云
    關(guān)鍵詞:進化樹腸道病毒核苷酸

    冉紹云

    (鄭州市第一人民醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

    皰疹性咽峽炎(Herpangina,HA)是較為多見的傳染性疾病,以人腸道病毒(HEVs)感染為主,發(fā)熱、咽痛、咽部皰疹是其主要臨床表現(xiàn)。該病多見于嬰幼兒,全年均可發(fā)生,傳染性強,易爆發(fā)流行[1]。絕大部分病例癥狀輕微,具有自限性,但少數(shù)病例病情會迅速惡化,可發(fā)展為重癥,嚴重時危及生命,即使存活也常會遺留嚴重后遺癥[2]。近年來,HA在全球范圍內(nèi)廣泛流行,國內(nèi)多個城市已經(jīng)發(fā)生爆發(fā)疫情[3,4]。然而,由于HA在國內(nèi)并非法定傳染病,相關(guān)研究報道尚少,尤其對其病原學(xué)的研究缺乏。因此,為了解本地區(qū)HA的病原學(xué)特征,本研究對238份HA糞便標本進行檢測分析,現(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    收集2017年2月~2018年12月由鄭州市第一人民醫(yī)院送檢的HA病例糞便樣本238份,所有標本均于冷藏條件下送檢。

    1.2 提取病毒RNA

    以無菌棉簽采集糞便樣本,放置在離心管(含有Hanks平衡鹽酸溶液600μL)中,再將離心管置于旋渦混合器中,予以振蕩,充分搖勻,再取8 000 g離心處理5 min。采集上清液約200 mL,采用High Pure Viral RNA kit試劑盒(Roche公司)進行病毒DNA提取,嚴格按說明書進行操作。

    1.3 RT-PCR

    采用碩世公司腸道病毒通用型、柯薩奇病毒A16(CVA16)和EV71熒光定量PCR試劑盒進行樣本RNA檢測。RT-PCR反應(yīng)體系:去RNA酶水3.5μL,酶混合液5μL,核酸擴增反應(yīng)液7.5μL。

    1.4 RT-snPCR

    以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將未分型的其他腸道病毒陽性樣本的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。行A組腸道病毒半巢式RT-PCR擴增,以HEVAS1495及HEVA2C作為首輪引物,以HEVAS1495及HEVAR2807作為次輪引物[5]。對A組腸道病毒VP1全基因篩查未能檢查的樣本,進一步行腸道病毒篩查,首輪引物采用224及222,次輪引物為AN89及AN88[6]。采用1.2%瓊脂糖凝膠110V對RT-snPCR擴增得到的產(chǎn)物進行電泳,處理30min后進行觀察,如檢測結(jié)果和預(yù)期片段相符,則判定屬于陽性。產(chǎn)物序列測定:(1)HEVAS1495:序列為5'-CAGTCTTCATCAGTTACCCTG-GTIATICCITGGATIAGYAACAC-3',基因區(qū)域為VP3,位置2192-2236;(2)HEVAR2C:5'-CGGTGYTTGCTCTTGAACTG-CATG-3',基因區(qū)域為2C,位置4409-4432;(3)HEVAR2807:序列為5'-CAGTTACACCGGGCAATCGTGT-CRCAICCYTGIGCIGTRG-3',基因區(qū)域為2A,位置3502-3463;(4)224:序列為5'-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3',基因區(qū)域為VP1,位置1977-1996;(4)222:序列為5'-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3',基因區(qū)域為VP1,位置2969-2951;(5)AN89:序列為5'-CCAGCACTGACAGCAGYN-GARAYNGG-3',基因區(qū)域為VP1,位置2602-2627;(6)AN88:序列為5'-TACTGGACCACCTGGNGGNAYR-WACAT-3',基因區(qū)域為VP1,位置2977-2951。

    1.5 生物信息學(xué)獲取

    行測序結(jié)果比對(BLAST工具)。行序列作剪切處理(Bioedit軟件),并行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。參考毒株序列統(tǒng)一來源于NCBI的GenBank。

    2 結(jié)果

    2.1 RT-PCR結(jié)果

    238份HA病例標本經(jīng)熒光RT-PCR檢測顯示,共204例腸道病毒陽性,陽性率為87.39%(208/238);其中EV71占1.92%(4/208),CA16占20.19%(42/208),其他腸道病毒占77.88%(162/208)。

    2.2 RT-snPCR結(jié)果

    162份其他病毒陽性標本經(jīng)RT-snPCR擴增,電泳顯示特異性條帶159份,陽性率為98.15%(159/162)。所有特異性條帶均測序成功。通過BLAST對測序結(jié)果進行分析,鑒別出CA2、CA5、CA6及CA10四種病毒,分別占樣本總數(shù)的21.85%(52/238)、4.20%(10/238)、29.83%(71/238)、10.92%(26/238)。

    2.3 生物信息學(xué)分析

    將本組測得的CA6、CA2序列和下載的參考序列(CA6序列41例,CA2序列25例)共同構(gòu)建進化樹,參考株序列源自GenBan。以VP1基因為基礎(chǔ)構(gòu)建進化樹,結(jié)果顯示,從2017年~2018年該地區(qū)HA病例中分離的CA6病毒株都屬于B基因型。這和國內(nèi)其他地區(qū)近年分離的B基因型較近,而和國外結(jié)果基因分屬不同。序列同源性分析顯示,71株CA6序列VP1區(qū)核苷酸、氨基酸同源性分別為95.8%~100%、97.5%~100%,52株CA2毒株間核苷酸及氨基酸同源性分別為91.2%~99.2%、92.6%~100%。進化樹和近年深圳、上海、香港分支屬于同一支,且和香港2012年的CA2流行株高度相似,核苷酸及氨基酸同源性分別為90.8%~99.7%、91.9%~100%。

    3 討論

    既往報道顯示,A組腸道病毒感染所致的HA癥狀通常較為輕微,但近年也有研究報道,該組病毒感染也會導(dǎo)致嚴重并發(fā)癥,同時HA可增加手足口病聚集風(fēng)險[3,7]。然而目前HA尚未受到足夠重視,防控方面仍存在諸多不足。加強HA的監(jiān)測對兒童健康成長有著重要意義。

    本組監(jiān)測的HA病例糞便標本中,共發(fā)現(xiàn)6種類型病變體,即CA2、CA5、CA6、CA10、CA16及EV71,它們都歸屬于A組腸道病毒,未發(fā)現(xiàn)其他組腸道病毒,與既往報道一致[8]。法國2010年的報道顯示HA病例主要流行株為CA6及CA10為HA病例主要流行株[9],泰國2012年為CA6和CA8[10]。本研究顯示,CA6是導(dǎo)致HA發(fā)生的主要流行株,CA2次之,這可能是區(qū)域差異引起的,但柯薩奇病毒為主要病原。

    本研究采用擴增VP1全序列法對HA病例中CA6遺傳進化予以分析發(fā)現(xiàn),CA6序列VP1區(qū)核苷酸同源性為95.8%~100%,氨基酸同源性為97.5%~100%,和國內(nèi)近年報道的B基因病毒株一致性較高。CA6近年來在多個地區(qū)活躍度越來越高,逐漸成為腸道病毒的主要流行株,逐漸取得了EV71及CA16[11]。隨著感染人數(shù)不斷增多,腸道病毒CA6基因突變的幾率也會隨之增大,而隨著變異的日積月累,其越可能出現(xiàn)爆發(fā)流行。故應(yīng)加強CA6的監(jiān)測。前期報道顯示,CA2所致感染癥狀多輕微,以HA為主[4]。但香港于2012年發(fā)生了CA2感染患兒死亡的病例[12]。而本研究中CA2毒株和上述香港報道的CA2毒株屬同分支,有著密切的進化關(guān)系,核苷酸同源性為90.8%~99.7%,氨基酸同源性為91.9%~100%。鑒于CA2病毒感染也可引起嚴重事件,故也有必要加強CA2監(jiān)測。

    綜上所述,對于HA監(jiān)測,不僅需重視EV71、CA16之外腸道病毒的監(jiān)測,還需針對CA6型進行分型鑒定,并且應(yīng)加強CA2重組毒株的監(jiān)測,以為該地區(qū)的防控提供指導(dǎo)。

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