不同激素組合對(duì)唐古特大黃愈傷組織的影響

哈斯其美格， 曹 忻， 李海玲， 張 洋

(1. 西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州730030;2. 雙澤管理咨詢公司，山東 濟(jì)南250000)

大黃作為我國(guó)特產(chǎn)的傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名為“將軍”，《中國(guó)藥典》收載為蓼科大黃屬植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖。前兩種主產(chǎn)于青海、甘肅，習(xí)稱北大黃，品種較優(yōu)，后一種主產(chǎn)于四川，習(xí)稱南大黃。民間根莖入藥，味苦性寒，具有“瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血化瘀”之功效［1-3］。

唐古特大黃，分布于青藏高原，是一種常用藏藥，又稱“雞爪大黃”，是青海省重要的特色藥物資源之一，產(chǎn)量大，品質(zhì)優(yōu)，在國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)。目前，唐古特大黃資源一直依賴野生植物的采收，由于得不到有效的保護(hù)，導(dǎo)致野生大黃資源日益減少、近于枯竭。通過組織培養(yǎng)技術(shù)人工繁殖大黃，既可保護(hù)野生資源，又可滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求［4-6］。本實(shí)驗(yàn)選用唐古特大黃種子萌發(fā)的無菌苗為材料，對(duì)唐古特大黃中蒽醌類次生代謝物質(zhì)的生物合成途徑進(jìn)行了初步探索，研究了不同激素對(duì)唐古特大黃愈傷組織的影響，以便為唐古特大黃中蒽醌物質(zhì)生物合成途徑的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Regel.)，采于青海省黃南藏族自治州澤庫縣。

1.2 儀器 手提式壓力蒸氣消毒器YX-280B 型(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠);DELTA320pH 計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);WGP-350 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海安亭科學(xué)儀器廠);S.HS-1300 水平送風(fēng)凈化工作臺(tái)(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 取唐古特大黃飽滿粒大的種子，在水中浸泡10 h，將種皮剝?nèi)?。在超凈工作臺(tái)上，將種子先用75%乙醇溶液浸泡45 s，再用0.1%的HgCl2浸泡15 min，然后用無菌水清洗5 遍。將種子剝開，取出胚，將其接種到MS 固體培養(yǎng)基表面上。在25 ℃左右，于培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)約3 周后，即可誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.3.2 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇 以MS 為基本培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中添加不同組合的激素(見表1)。本研究使用的是常用激素2，4-D、6-BA、NAA。

1.3.3 生產(chǎn)培養(yǎng)基的選擇 從不同激素組合的培養(yǎng)基(見表1)中培養(yǎng)出愈傷組織，分別測(cè)定它們的蒽醌量［4］。

表1 培養(yǎng)基中不同的激素組合

1.3.4 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 每隔4 周時(shí)間，要對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中，并在轉(zhuǎn)接時(shí)用天平稱量愈傷組織的質(zhì)量變化，以對(duì)其生長(zhǎng)速率做出分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)唐古特大黃愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 外植體在接種大約一周后開始膨大，約3 周后開始形成愈傷組織。激素2，4-D 單獨(dú)存在時(shí)，2，4-D 組(1、2、3)愈傷組織誘導(dǎo)率分別為65.4%、73.3%和68.5%。在激素2，4-D 質(zhì)量濃度一定的情況下，添加質(zhì)量濃度遞增的激素6-BA 后，相對(duì)于2，4-D 組，A、B、C 組的誘導(dǎo)率明顯升高。但激素6-BA 的質(zhì)量濃度變化對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響不大。在激素6-BA 質(zhì)量濃度(2 mg/L)一定的情況下，觀察激素2，4-D 質(zhì)量濃度變化對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著激素2，4-D 質(zhì)量濃度的增加，相對(duì)于A、B、C 組，D、E、F 組誘導(dǎo)率明顯升高。當(dāng)激素2，4-D 質(zhì)量濃度為2 mg/L 時(shí)，D 組在D、E、F三組中誘導(dǎo)率最高，但激素2，4-D 質(zhì)量濃度超過2 mg/L后，相對(duì)于D 組，E、F 組誘導(dǎo)率又隨之降低。在激素2，4-D、6-BA質(zhì)量濃度一定的情況下，添加另一種激素NAA，相對(duì)于D 組G、H、I 組誘導(dǎo)率升高，但無顯著的差距，說明生長(zhǎng)素NAA 對(duì)誘導(dǎo)率的變化無顯著的影響。見表2。

表2 不同激素組合的愈傷誘導(dǎo)情況

2.2 對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)速率的影響 在半年的繼代培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，每隔4 周，對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中。每次轉(zhuǎn)接時(shí)，稱量每組愈傷組織的質(zhì)量變化，用于生長(zhǎng)速率分析。所得的數(shù)據(jù)如表3。

表3 愈傷組織的生長(zhǎng)情況

對(duì)表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G、H、I 3 組培養(yǎng)基的愈傷組織的生長(zhǎng)速率是最大的(見圖1)。D、E、F 3 組的生長(zhǎng)速率比A、B、C 3 組稍大，但無明顯差距。內(nèi)部比較時(shí)，A、B、C 3 組之間基本持平，說明激素6-BA 質(zhì)量濃度的變化對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)速率亦無明顯效應(yīng);D、E、F 3 組之間，F(xiàn) 組的生長(zhǎng)速率較其他兩組要稍大;G、H、I 3 組之間，H 組最大。而且G、H、I 3 組的愈傷誘導(dǎo)率也是最大的，說明H 組是愈傷組織最佳的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

圖1 愈傷組織的生長(zhǎng)速率

2.3 對(duì)愈傷組織中蒽醌量的影響 在不同的激素刺激下，愈傷組織顯示出不同大小的蒽醌合成能力(見圖2)。從圖中可以看出，A、B、C 3 組之間無明顯規(guī)律，相差亦不大;D、E、F 3 組的量是逐漸減少的，說明大劑量的激素2，4-D對(duì)蒽醌的合成有一定程度的抑制作用;G、H、I 3 組仍然是最高的，相差亦不大。說明H 組是愈傷組織最佳的生產(chǎn)培養(yǎng)基。

圖2 愈傷組織中的蒽醌量比較

3 討論

3.1 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響 激素作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有著各自獨(dú)特的作用［7-10］。本實(shí)驗(yàn)中，激素2，4-D 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)起著主導(dǎo)性的作用。單獨(dú)使用時(shí)就有較高的誘導(dǎo)率，加入激素6-BA后，誘導(dǎo)率顯著提高。在激素6-BA 質(zhì)量濃度不變的情況下，誘導(dǎo)率隨激素2，4-D 質(zhì)量濃度變大而提高，2 mg/L 時(shí)最大，而后逐漸降低。這說明激素2，4-D 的促進(jìn)誘導(dǎo)作用有個(gè)最適質(zhì)量濃度，高于這個(gè)質(zhì)量濃度，反而對(duì)愈傷誘導(dǎo)有抑制作用。

生長(zhǎng)素NAA 對(duì)誘導(dǎo)率的影響并不是很大，可能是因?yàn)镹AA 所需的作用時(shí)間太長(zhǎng)所致，這也符合張素勤等［11-15］的研究結(jié)果。NAA 誘導(dǎo)非洲菊葉片愈傷組織所需時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)NAA 為0.5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)出愈傷組織需26 d。NAA 誘導(dǎo)得愈傷組織量少，而且生長(zhǎng)緩慢。但在本實(shí)驗(yàn)中，NAA對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)速率有較大的促進(jìn)作用。這可能是與加速6-BA 配合的結(jié)果。

3.2 不同激素對(duì)愈傷組織中蒽醌量的影響 本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于愈傷組織中的蒽醌產(chǎn)量，激素6-BA 無明顯作用;激素2，4-D 在質(zhì)量濃度為2 mg/L 時(shí)效果最好，高質(zhì)量濃度有較強(qiáng)的抑制作用，且質(zhì)量濃度越高，抑制越強(qiáng);1.0 mg/L 以上質(zhì)量濃度的激素NAA 對(duì)2，4-D 有增效作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A、B、C、D、E、F、G、H、I 組中，H 組是唐古特大黃愈傷組織最佳的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基。2，4-D，6-BA，NAA 3 種不同激素組合的最佳培養(yǎng)基是:MS +2，4-D (2 mg/L) +6-BA (2 mg/L) + NAA(1 mg/L)，在此培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長(zhǎng)速率和蒽醌的產(chǎn)量都有較佳的表現(xiàn)。

［1］ 李安仁. 中國(guó)植物志:第25 卷［M］. 北京:科學(xué)出版社，1998:184-186.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:22-23.

［3］ Li S J，Dong X H，Wu H X，et al. Review of Rhubarb and pharmaceutical effects of its effective constitutes［J］. Medical Recapitulate，2005，11(1):76-78.

［4］ 李玉林，索有瑞，王洪倫，等. 人工栽培唐古特大黃中總蒽醌含量水平的分析［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(5):1020 -1022.

［5］ 肖春橋，高 洪，池汝安，等. 誘導(dǎo)子促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的研究進(jìn)展［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16(5):473 -476.

［6］ 杜麗娜，張存莉，朱 瑋，等. 植物次生代謝合成途徑及生物學(xué)意義［J］. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20 (3):150-155.

［7］ 王和勇，羅 恒，孫 敏，等. 誘導(dǎo)子在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］. 中草藥，2004，8(3):52 -55.

［8］ Dong X J，Wang L，Xu W H，et al. Plantlet regeneration from dormancy buds of Rheum tanguticum［J］. Plant Physiol Commun，2004，40(4):45.

［9］ 趙 芳，倪 良，耿 征，等. 南方紅豆杉組織培養(yǎng)研究［J］. 中草藥，1999，30(3):213-215.

［10］ 唐建軍，項(xiàng)田夫，張祿源，等. 植物次生代謝、離體培養(yǎng)條件下次生代謝物積累及其調(diào)控研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)野生植物資源，1998，17(4):1-6.

［11］ 張素勤，鄒志榮，耿廣東，等. 培養(yǎng)基和植物激素對(duì)非洲菊葉片愈傷誘導(dǎo)的研究［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(10):29-32.

［12］ 劉文哲，張愛新. 大黃蒽醌類化合物的組織化學(xué)定位研究［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2000，20(6):1082-1085.

［13］ 項(xiàng)雷文，郭麗梅. 前體物對(duì)粉葛細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝的影響［J］. 福建師范大學(xué)福清分校學(xué)報(bào)，2004，2 (5):50-53.

［14］ 徐文華，陳桂琛，李 毅，等. 唐古特大黃組織培養(yǎng)技術(shù)的研究［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(9):1731-1738.

［15］ 于榮敏，馬 娜，嚴(yán)春艷，等. 外源激素對(duì)何首烏毛狀根生長(zhǎng)及蒽醌類成分生物合成的影響［J］. 生物工程學(xué)報(bào)，2006，4(3):58-64.