濱海白首烏黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化

孫 倩,馮 進(jìn),李春陽(yáng)*, Chuon Mony Roth, Sun Sovath, Taing Bunhok

(1.南京理工大學(xué) 化工學(xué)院,江蘇 南京 210094;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;3.柬埔寨農(nóng)業(yè)漁業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品和食品實(shí)驗(yàn)室,金邊 10103)

濱海白首烏又稱(chēng)白人參,它不僅是濱海有名的傳統(tǒng)特產(chǎn),還是中國(guó)傳統(tǒng)的“藥食同源”食材、中藥材。現(xiàn)代藥理活性研究表明:白首烏具有抗腫瘤、抗衰老、抗缺氧、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能等生物活性[1-3]。目前,從白首烏中分離得到的化學(xué)成分有C21甾苷、磷酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖、氨基酸以及維生素等[4-5]。黃酮類(lèi)化合物是由植物在光合作用下產(chǎn)生的一大類(lèi)化合物,其一般具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[6-8]。超聲波輔助提取技術(shù)是一種有效的分離技術(shù),它主要是采用超聲波的空化作用,即當(dāng)一定頻率的超聲波開(kāi)始作用于溶液時(shí),液體中大小適宜的小氣泡會(huì)發(fā)生共振現(xiàn)象,強(qiáng)有烈的沖擊波會(huì)使細(xì)胞壁破裂,其中的有效物質(zhì)溶出,并且整個(gè)體系不會(huì)因溫度大幅升高而破壞掉其中的有效成分,能強(qiáng)化浸提效率,而且高效、節(jié)能、省時(shí),因而具有極高的應(yīng)用價(jià)值[9-10]。此方法在天然產(chǎn)物浸提方面得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了濱海白首烏黃酮的提取工藝,以期為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)白首烏提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濱海白首烏粉末，由鹽城果老首烏科技有限公司提供;蘆丁對(duì)照品，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁,均為分析純;試驗(yàn)用水為二次去離子水。

BS210S型電子天平，為北京Sartorious公司的產(chǎn)品; UV1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，為上海奧析科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品; KQ-100DB超聲波清洗儀，為昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品; SHZ-D型循環(huán)水真空泵，為鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品; DHQ-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，由上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[11]準(zhǔn)確稱(chēng)取10.6 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中,用80%的乙醇溶液溶解后定容于50 mL的容量瓶中,搖勻,得到濃度為0.212 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。分別精密移取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL比色管中,再分別加入80%乙醇溶液至總體積3 mL;再加5%亞硝酸鈉0.4 mL，混勻;放置6 min后加入10%硝酸鋁0.4 mL，混勻;放置6 min后再加入4%氫氧化鈉4 mL,均用蒸餾水定容至10 mL,充分混勻,放置15 min。以第1管作為空白,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,以吸光度值對(duì)應(yīng)蘆丁濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確移取0.212 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液3.0 mL,按1.2.1中的方法平行測(cè)定吸光度值5次,計(jì)算其吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確移取5份0.212 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL,依次按1.2.1中的方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算其吸光度的RSD值。

1.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確移取5份0.12 mg/mL的白首烏黃酮提取液1.0 mL,分別精確加入0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg蘆丁對(duì)照品,按1.2.1中的方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算回收率?；厥章?(加標(biāo)樣品含量-樣品含量)/加標(biāo)量×100。

1.2.5 白首烏總黃酮的提取工藝 準(zhǔn)確稱(chēng)取白首烏塊根的干燥粉末0.50 g于50 mL具塞錐形瓶中,按要求加入一定量的乙醇溶液,利用超聲波法協(xié)同有機(jī)溶劑輔助提取工藝,在一定溫度、一定功率下超聲提取一定時(shí)間,抽濾,將得到的提取液定容于25 mL的容量瓶中，待測(cè)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]

1.2.6.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白首烏粉末，置于具塞錐形瓶中,按液料比20∶1向其中加入體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇,在超聲時(shí)間為25 min、超聲溫度為50 ℃、超聲功率為400 W的條件下提取,抽濾定容得到提取液；移取1 mL提取液，按1.2.1中的方法測(cè)定其吸光度,計(jì)算總黃酮提取量；做3次平行試驗(yàn),探究乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.6.2 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白首烏粉末，置于具塞錐形瓶中,按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1分別向其中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,在超聲時(shí)間25 min、超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W的條件下提取；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究液料比對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.6.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,在超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min,超聲溫度50 ℃,超聲功率400 W的條件下提??；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.6.4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,在超聲時(shí)間20 min,超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,超聲功率400 W的條件下提?。黄溆嗖僮魍?.2.6.1中的操作,探究超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.6.5 超聲功率對(duì)總黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,在超聲時(shí)間20 min,超聲溫度40 ℃,超聲功率分別為240、280、320、360、400 W的條件下提??；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究超聲功率對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取其中的乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)和超聲溫度(D)4個(gè)主要因素為考察因素,在4個(gè)因素里面分別選擇對(duì)白首烏總黃酮提取量影響較大的3個(gè)水平,選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),以濱海白首烏中的總黃酮提取量為考察指標(biāo),每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,確定最佳的提取工藝組合。

1.2.8 白首烏中黃酮含量的測(cè)定方法 移取1 mL提取液置于10 mL比色管中,按1.2.1中的方法測(cè)定其吸光度,由回歸方程可得到總黃酮含量,再根據(jù)下式計(jì)算出總黃酮提取量。

y=(cV1V3)/(V2W)

上式中：y為總黃酮提取量(mg/g);c為移取液的黃酮濃度(mg/mL);V1為移取液的定容體積(mL);V2為移取液的體積(mL);V3為藥材提取液的定容體積(mL);W為藥材質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016、Origin 8.0、SPSS Statistics 23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以吸光度值(A)為縱坐標(biāo),以蘆丁溶液濃度(c)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到回歸方程A=10.883c-0.0076,R2=0.9989;結(jié)果表明,當(dāng)蘆丁濃度在0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)時(shí),其與吸光度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

5次測(cè)定的吸光度值分別為0.692、0.687、0.691、0.678、0.689，計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.81%,表明本試驗(yàn)結(jié)果的精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

5次測(cè)定的吸光度值分別為0.217、0.225、0.219、0.223、0.220，計(jì)算得到其RSD為1.45%,表明本試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明：平均回收率為99.2%, RSD為1.57%,證明該方法準(zhǔn)確性高。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖1可知,伴隨乙醇濃度的增加,白首烏總黃酮提取量先逐漸增大;當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí),提取量最高,達(dá)到2.37 mg/g；此后繼續(xù)增大乙醇濃度,提取量下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度較低時(shí),黃酮類(lèi)化合物還未充分溶解,而當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí),溶劑極性降低,脂溶性等雜質(zhì)溶出,與黃酮類(lèi)化合物競(jìng)爭(zhēng)同種溶劑[13-15],導(dǎo)致總黃酮提取量降低。故確定最佳乙醇濃度為80%。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響

2.5.2 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著液料比升高,總黃酮提取量先升高；在液料比為30∶1時(shí)提取量最高,達(dá)到3.02 mg/g；但繼續(xù)增加液料比時(shí)提取量下降。這可能是因?yàn)槿軇┯昧枯^少時(shí),與物料接觸不充分,黃酮類(lèi)化合物提取不完全,而當(dāng)溶劑用量過(guò)多時(shí),會(huì)導(dǎo)致除黃酮之外的其他雜質(zhì)溶出[13,16]。故確定最佳液料比為30∶1。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響

2.5.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響 從圖3可以看出：當(dāng)超聲時(shí)間在20～50 min內(nèi)增加時(shí),總黃酮提取量呈降低趨勢(shì)；而當(dāng)超聲時(shí)間在10～20 min范圍內(nèi)增加時(shí),提取量呈增大趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ臅r(shí)間內(nèi),超聲波有利于增加白首烏中黃酮類(lèi)化合物的溶出,但當(dāng)提取時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),溫度較高,溶劑揮發(fā),部分黃酮可能會(huì)被氧化,黃酮類(lèi)化合物分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,使得提取量降低[9,17]。故確定最佳超聲時(shí)間為20 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

2.5.4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖4可見(jiàn)：當(dāng)超聲溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)升高時(shí),總黃酮提取量呈增大趨勢(shì)；隨著超聲溫度在40～50 ℃范圍內(nèi)逐漸升高,總黃酮提取量呈下降趨勢(shì)；隨著超聲溫度在50～70 ℃范圍內(nèi)升高,總黃酮提取量變化不大。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲溫度低時(shí),超聲波頻率較小,溶質(zhì)還未充分接觸溶劑,提取量低；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),部分黃酮類(lèi)物質(zhì)可能被氧化或分解,并且加速其他雜質(zhì)的溶出，致使提取量降低[18]。同時(shí)可以看出超聲提取法的最佳溫度遠(yuǎn)低于水浴提取法的最佳溫度[19]。因此,確定最佳超聲溫度為40 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

2.5.5 超聲功率對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖5可知：在240～280 W的超聲功率范圍內(nèi),總黃酮提取量呈增大趨勢(shì)；隨著超聲功率在280～400 W范圍內(nèi)逐漸升高,總黃酮提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵龃蟪暡üβ蕰?huì)加強(qiáng)細(xì)胞的破碎力度,從而使得黃酮溶出量加大；但是過(guò)度增加超聲波功率,不僅會(huì)增加能耗,而且因其強(qiáng)烈的空化作用會(huì)破壞有效成分,導(dǎo)致提取量降低[20-21]。因此,最佳超聲功率為280 W。

圖5 超聲功率對(duì)總黃酮提取量的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)各因素的水平如表2所示,結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)各因素的水平

由表3可知,各個(gè)因素水平對(duì)總黃酮提取量有不同的影響,由極差分析結(jié)果可知,4個(gè)因素對(duì)提取量的影響大小為A>B>C>D,確定的最佳提取工藝條件是A3B1C3D2；在此組合條件下,進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),總黃酮平均提取量為3.95 mg/g，高于鄒艷敏[22]用回流法和微波法提取的白首烏黃酮量(3.53 mg/g)。與張鋒等[19]用水浴回流提取法提取的白首烏黃酮量(2.8544 mg/g)相比,本試驗(yàn)提取的總黃酮量不僅大幅增加,而且使用超聲波輔助法提取白首烏黃酮操作方便,提取時(shí)間(3 h)也大大減少。

表3 正交試驗(yàn)方案和結(jié)果

由表4可知：在采用超聲輔助法提取白首烏總黃酮的工藝中,A因素(F0.1

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)以濱海白首烏為研究對(duì)象,以總黃酮為目標(biāo)化合物,對(duì)超聲波輔助提取濱海白首烏總黃酮的工藝進(jìn)行了系統(tǒng)地探究,得到的最佳提取工藝為:乙醇濃度90%、超聲時(shí)間30 min、液料比20∶1,超聲溫度40 ℃。在此最佳條件下,白首烏中總黃酮提取量為3.95 mg/g。對(duì)超聲波輔助法提取有影響的因素較多,鑒于此,我們對(duì)白首烏總黃酮提取的其他影響因素還需進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討白首烏黃酮等成分的提取提供了參考依據(jù)。