基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)研究Pokemon誘導(dǎo)的胞內(nèi)脂代謝變化

金一寶,李上富,王 玨,高 丹,劉紅霞,蔣宇揚(yáng),殷 果,王鐵杰*

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院,深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518057;2.清華大學(xué)深圳研究生院,廣東 深圳 518055)

Pokemon蛋白是由染色體19p13.3區(qū)帶ZBTB7A基因編碼的產(chǎn)物,作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,能夠通過影響染色質(zhì)的重組或直接與抑癌基因結(jié)合而抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄,從而促使腫瘤形成[1,2]。2005年美國癌癥研究中心[3]提出Pokemon的調(diào)控機(jī)制可能是通過Pokemon-ARF(alternative reading frame)-MDM2(murine double minute2)-P53細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路。Zu等[4]繪制了Pokemon介導(dǎo)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)Pokemon的調(diào)控作用主要分布在代謝、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)中,其中有74個(gè)基因與機(jī)體代謝有關(guān),涉及44條代謝途徑。但Pokemon在腫瘤基因調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)中所起作用還不是十分清晰,需要進(jìn)一步的研究。

代謝組學(xué)是近年來新的研究技術(shù)手段,是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后系統(tǒng)生物學(xué)的另一重要研究領(lǐng)域,主要研究生命體在受外界或自身改變的情況下小分子代謝物的變化[5,6]。代謝物處于基因組和蛋白質(zhì)組的下游,通過研究代謝物的變化,反推基因和酶的調(diào)控過程。代謝組學(xué)作為一種新的組學(xué)方法在疾病機(jī)制研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。目前,代謝組學(xué)已在腫瘤發(fā)病機(jī)理、腫瘤標(biāo)志物鑒定、疾病診斷、動(dòng)物模型、藥物毒性和機(jī)理研究、基因功能的闡明等方面取得了突破和進(jìn)展[8-12]。

本文利用代謝組學(xué)技術(shù),比較了肝細(xì)胞HL7702瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Pokemon基因所獲得的高表達(dá)細(xì)胞與對照組細(xì)胞的代謝途徑和代謝物質(zhì)的變化,獲得了Pokemon介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞代謝差異,探討肝細(xì)胞中Pokemon引發(fā)的小分子代謝物、酶和調(diào)控基因之間的相互關(guān)系,研究Pokemon作為原癌基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和功能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

HF safe1500生物安全柜、HF240型二氧化碳培養(yǎng)箱(中國力康),IX5型倒置相差顯微鏡(日本Olympus),超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC/Q-TOF MS,美國Waters),Direct-QTM超純水設(shè)備(美國EMD Millipore),Allegra 64R高速控溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter)。

pEGFP-N3/Pokemon及pEGFP-N3質(zhì)粒由清華大學(xué)深圳研究生院保存;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列由吉泰生化(中國)合成;Trizol、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于life technologies(美國);乙腈(LC-MS級)、甲醇(HPLC級)、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、顯影定影試劑盒、1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Thermo Fisher Scientific(美國);Pokemon抗體、甲酸(LC-MS級)、亮氨酸-腦啡肽(LE,200 μg/L)均購于Sigma-Aldrich(美國);己糖激酶(hexokinase)抗體、肝磷酸果糖激酶(PFKL)抗體、丙酮酸激酶(PKM1/2)抗體、乙酰輔酶α羧化酶(Accα)抗體、脂肪酸合成酶(FASN)抗體均購于Cell Signaling Technology(美國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒均購于寶生物工程有限公司(中國);彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊二抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于碧云天生物技術(shù)研究所(中國);0.22 μm尼龍濾膜購自天津博納艾杰爾科技有限公司(中國);超純水由Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

1.2 Pokemon高表達(dá)的HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HL7702細(xì)胞為人類肝來源的上皮細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞庫),在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)HL7702細(xì)胞,使其12～16 h后細(xì)胞融合度達(dá)到75%～80%。按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明,分別用優(yōu)化培養(yǎng)基稀釋pEGFP-N3/Pokemon質(zhì)粒(對照組細(xì)胞,采用pEGFP-N3質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染)和LipofectamineTM2000,混合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑,靜置20 min,使脂質(zhì)體充分包覆質(zhì)粒。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,更換無雙抗的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染試劑滴入培養(yǎng)皿中,在37 ℃、5%CO2濃度的環(huán)境下培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基,通過觀察熒光表達(dá)判斷轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

1.3 Realtime PCR

細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)約為2×105個(gè),利用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,取1 μg總RNA,加入DNA酶、無RNA酶水和RNA酶抑制劑,去除體系中可能的DNA污染。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA。將所得到的cDNA采用Realtime PCR試劑盒配制20 μL的反應(yīng)體系,上游引物5′-GAAGCCCTACGAGTGCAACATC-3′、下游引物5′-TGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG-3′(147 bp)。PCR反應(yīng)條件按照三步法進(jìn)行:第一步,1次循環(huán),95 ℃維持10 s;第二步,40次循環(huán),95 ℃變性5 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延長34 s;第三步,解離延長步驟。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算細(xì)胞中Pokemon的mRNA水平表達(dá)差異。

1.4 免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞中加入已預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,提取蛋白質(zhì),通過蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。配制SDS(十二烷基磺酸鈉)-聚丙烯酰胺凝膠,將已處理好的樣品及彩色預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加于上樣孔內(nèi),恒壓電泳。取出電泳凝膠,采用恒流電泳將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜,室溫封閉。加入用0.05 g/mL BSA(牛血清白蛋白)溶液稀釋的抗體,于4 ℃孵育過夜。洗膜后,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育后洗膜。使用顯影定影試劑盒通過凝膠成像系統(tǒng)掃描,檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對濃度,以條帶的濃淡呈現(xiàn)。

1.5 細(xì)胞的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1細(xì)胞樣品前處理

細(xì)胞生長狀態(tài)達(dá)到對數(shù)生長期(90%融合率),用預(yù)冷的PBS清洗兩次,計(jì)數(shù)1×107個(gè)細(xì)胞,置于離心管中,離心棄去PBS,加入600 μL甲醇-水(3∶1,v/v),旋渦混合。冰浴超聲破碎,在4 ℃以16 000 g的速度離心10 min[13]。取上清液,用氮?dú)獯蹈?用1 mL乙腈-水(1∶1,v/v)復(fù)溶,加入LE(質(zhì)量濃度為200 μg/L,溶劑為乙腈-水=1∶1,v/v)為內(nèi)標(biāo),在4 ℃以16 000 g的速度離心10 min,用0.22 μm尼龍濾膜過濾,置樣品瓶中,進(jìn)樣分析。

1.5.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

色譜采用Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters)。流動(dòng)相A為水(含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸),流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序(體積分?jǐn)?shù)):初始比例為5%B,在8 min內(nèi)線性增長至98%B,然后保持2 min,隨后恢復(fù)為5%B,并平衡2 min。流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣室溫度為4 ℃,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜使用電噴霧電離源(ESI),采用正離子檢測模式,錐孔電壓為40 V,采集時(shí)間為0.2 s,采集間隔為0.02 s。掃描范圍為m/z100～1 000。使用鎖定質(zhì)量模式(lock mass)對儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正,參考物質(zhì)為質(zhì)量濃度為100 μg/L的LE溶液(溶劑為乙腈-水=1∶1,v/v),流速為0.05 mL/min,采集間隔為10 s。

1.5.3數(shù)據(jù)處理

采用MarkerLynxXS軟件(V4.1,Waters)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰識別、譜圖濾噪、基線校正以及峰匹配,并通過讀取總離子流色譜圖中峰信息,利用軟件中包含的Ezinfo軟件根據(jù)上述變量進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì),以主成分分析(PCA)對變量進(jìn)行降維并將其聚類,繪制主成分分類圖。

1.5.4標(biāo)記物鑒定

將所選出的差異代謝物,根據(jù)其m/z,通過數(shù)據(jù)庫檢索,獲得其可能結(jié)構(gòu),并利用Q-TOF MS/MS采集二級質(zhì)譜圖進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞內(nèi)Pokemon表達(dá)水平

觀察HL7702細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果(見圖1a),可看出在12 h時(shí)已有細(xì)胞表達(dá)出綠色熒光,48 h后達(dá)到熒光比例最多,72 h持續(xù)該狀態(tài),96和120 h熒光減弱。分別收集轉(zhuǎn)染后12、24、48、72、96及120 h的細(xì)胞進(jìn)行Realtime PCR和Western Blot驗(yàn)證細(xì)胞中Pokemon的表達(dá)效率。從圖1b中,可看出HL7702細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h時(shí),Pokemon的mRNA表達(dá)水平升至最高,而蛋白質(zhì)表達(dá)水平的升高要在48 h才能達(dá)到最高(見圖1c)。在72 h后,隨時(shí)間的延續(xù),表達(dá)水平出現(xiàn)降低。該結(jié)果與綠色熒光照片的結(jié)果一致。

2.2 細(xì)胞代謝組學(xué)分析

2.2.1代謝指紋圖譜

采用超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對已構(gòu)建的Pokemon高表達(dá)的HL7702細(xì)胞株與其對照組細(xì)胞進(jìn)行分析,分別按轉(zhuǎn)染后12、24、48、72和120 h觀察Pokemon影響下的細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化。通過色譜分離和質(zhì)譜檢測,得到細(xì)胞的總離子流色譜圖,對比圖2中細(xì)胞代謝物的指紋圖譜(轉(zhuǎn)染后48 h),發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞相比,色譜圖之間峰形具有差異。比如,在4.13、6.77、7.60以及8.30 min前后的色譜峰有明顯不同,表明兩組細(xì)胞的代謝物含量發(fā)生了變化。

圖1 HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染Pokemon基因后Pokemon的表達(dá)(n=3)Fig.1 Expression of Pokemon in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene (n=3)a.fluorescent expression;b.mRNA expression (n=3);c.protein expression.Pokemon+:Pokemon overexpressing cells.

圖2 HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染Pokemon基因48 h后總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of HL7702 cells transfected with the Pokemon gene at 48 ha.Pokemon overexpressing cells;b.control cells.

圖3 HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染Pokemon基因后12、24、48、72及96 h細(xì)胞的主成分分類圖(n≥5)Fig.3 PCA (principal components analysis)of HL7702 cells transfected with the Pokemon gene at 12,24,48,72,and 96 h (n≥5)HP:Pokemon overexpressing cells;HN:control cells.

2.2.2主成分分析

根據(jù)獲得的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù),采用MarkerLynxXS軟件分析得到細(xì)胞主成分分類圖。從圖3細(xì)胞的分類及分布趨勢圖中可看出,HL7702轉(zhuǎn)染Pokemon基因后能夠與對照組細(xì)胞分類,并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(0～48 h)分類越來越明顯。另外在圖3中還可以看出Pokemon高表達(dá)的HL7702細(xì)胞與對照組細(xì)胞呈現(xiàn)隨時(shí)間遠(yuǎn)離后又恢復(fù)的趨勢,說明Pokemon表達(dá)水平的改變對細(xì)胞的自身代謝產(chǎn)生了顯著的影響。

表1 Pokemon基因轉(zhuǎn)染48 h后的HL7702細(xì)胞與對照細(xì)胞相比胞內(nèi)代謝差異物鑒定Table 1 Identification of different intracellular metabolites between HL7702 cells transfected with the Pokemon gene and control cells at 48 h

Note:the levels of metabolites were increased (↑)or decreased (↓)in cells transfected with the Pokemon gene for 48 h relative to the levels in control cells.DG:diacylglycero;PAF:platelet activating factor;PC:phosphocholine;PS:phosphatidylserine;SM:sphingomyelin.

2.2.3差異代謝物鑒定

Pokemon表達(dá)水平的改變影響細(xì)胞的自身代謝,根據(jù)細(xì)胞主成分分類圖(見圖3)選擇轉(zhuǎn)染后48 h的兩組細(xì)胞進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析,篩選對分類具有較大貢獻(xiàn)的代謝物(p<0.05)。通過數(shù)據(jù)庫(HMDB[14]和METLIN[15])檢索和二級圖譜比對進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,發(fā)現(xiàn)在Pokemon影響下,多種胞內(nèi)代謝物與對照組細(xì)胞相比含量發(fā)生了變化,本試驗(yàn)確證了5種氨基酸類、4種核苷類代謝物以及27種脂類代謝物,結(jié)果見表1。

圖4 HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染Pokemon基因后4種代表性脂類在不同時(shí)間點(diǎn)的變化倍數(shù)(n=5)Fig.4 Fold change of four representative lipids at different time points in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene (n=5)

表1和圖4表明,在HL7702轉(zhuǎn)染Pokemon基因后,細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸類代謝物含量明顯增加,磷脂類代謝物同樣增加,而溶血磷脂類代謝物減少。通過查詢KEGG數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)軟脂酸(palmitic acid)作為脂質(zhì)合成的第一產(chǎn)物[16]和差異代謝物,在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)伴隨Pokemon的表達(dá)水平升高而升高,同時(shí)隨時(shí)間延續(xù),Pokemon表達(dá)水平逐漸恢復(fù),代謝差異物的含量變化水平有所回調(diào),推測Pokemon高表達(dá)后可激活細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成。

2.3 脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達(dá)水平

通過檢測Pokemon高表達(dá)對細(xì)胞中脂質(zhì)合成信號通路關(guān)鍵酶的影響來證實(shí)Pokemon對細(xì)胞脂質(zhì)合成通路的激活作用,ACCα和FASN是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成長鏈脂肪酸軟脂酸(palmitic acid)的關(guān)鍵酶。文獻(xiàn)[17]顯示,FASN在很多腫瘤中過表達(dá)和過活化。已有文獻(xiàn)證實(shí)Pokemon直接激活FASN[18],為癌細(xì)胞的快速增殖提供更多的磷脂膜成分。從圖5中可看出,伴隨Pokemon蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加,細(xì)胞內(nèi)的FASN表達(dá)水平明顯升高,其中FASN表達(dá)量增加的時(shí)間點(diǎn)與Pokemon轉(zhuǎn)染后過表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)吻合,同時(shí)ACCα的表達(dá)水平在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,也出現(xiàn)增加,說明ACCα可能是被Pokemon間接激活的。對關(guān)鍵酶表達(dá)水平的驗(yàn)證表明,Pokemon可激活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成途徑,促使細(xì)胞內(nèi)形成包含脂肪酸、磷脂、甘油二酯等大量的脂類物質(zhì)。所產(chǎn)生的大量磷脂類成分可用于構(gòu)建細(xì)胞膜,結(jié)合細(xì)胞內(nèi)增加的ATP等能量物質(zhì)用于細(xì)胞增殖[19],而這種細(xì)胞的大量無限性增殖是腫瘤形成過程中的關(guān)鍵步驟。

圖5 HL7702轉(zhuǎn)染Pokemon基因后不同時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶ACCα和FASN的表達(dá)水平Fig.5 Expression of ACCα (acetyl-CoA carboxylase α)and FASN (fatty acid synthase),key enzymes for lipid synthesis,at different time points in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene a.Pokemon overexpressing cells;b.control cells.

3 結(jié)論

利用LC-MS技術(shù),對不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染Pokemon基因的HL7702細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)研究。提取細(xì)胞的內(nèi)源性代謝物,利用LC-MS進(jìn)行分離和鑒定,獲得差異表達(dá)譜,通過多元統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到不同時(shí)間點(diǎn)的分類結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Pokemon表達(dá)水平發(fā)生變化時(shí),細(xì)胞內(nèi)的多種代謝物的量值也發(fā)生明顯改變,尤其是脂類代謝物。Pokemon高表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸類、磷脂類代謝物的量增加,溶血磷脂類代謝物的量減少,研究結(jié)果表明Pokemon高表達(dá)后可激活細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成。蛋白質(zhì)表達(dá)水平的驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)了Pokemon能夠激活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成途徑。本研究表明細(xì)胞內(nèi)Pokemon的高表達(dá),可以激活脂質(zhì)合成通路,促使細(xì)胞內(nèi)脂類合成加快,為癌細(xì)胞提供增殖所需的細(xì)胞膜原料。

致謝 感謝南伊利諾伊醫(yī)學(xué)院曹德良教授在生物學(xué)工作中的幫助與指導(dǎo)。