血清miR-34a、miR-200a水平與妊娠期糖尿病患者胰島素抵抗關系

王雪梅 林瑩瑩

1.青島市市立醫(yī)院東院(266011)；2.青島市婦女兒童醫(yī)院

妊娠期糖尿病(GDM)是導致不良妊娠結(jié)局的主要原因[1]，我國GDM發(fā)病率高達7%[2]。研究表明胰島素抵抗(IR)是引起GDM發(fā)病及造成不良妊娠結(jié)局的主要原因[3]。微小RNA(miRNA)在疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，妊娠期相關疾病與外周血miRNA表達水平的關系已成為臨床研究熱點。研究表明miR-200a在GDM患者血清和胎盤中表達上調(diào)，與GDM發(fā)生和分娩胎兒預后有關[4]。提示其可能參與GDM發(fā)病過程，但miR-200a表達水平與GDM患者IR關系尚未見報道。Shen等研究表明miR-34a在2型糖尿病患者外周血單核細胞中表達上調(diào)，可作為2型糖尿病患者診斷和治療的潛在生物標志物[5]。但miR-34a與GDM患者IR的關系尚不清楚。本研究探究血清miR-200a、miR-34a表達水平與GDM患者IR的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年4月—2016年12月在本院常規(guī)產(chǎn)前檢查孕婦，孕24～28周行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)確診為妊娠期糖尿病患者90例(GDM組)，GDM診斷標準參考相關診斷標準[6]。糖耐量正常孕婦60例(NGT組)。納入標準：①初產(chǎn)單胎活產(chǎn)孕婦；②妊娠24～32周；③孕期未使用皮質(zhì)激素；④孕期在我院進行連續(xù)產(chǎn)檢；⑤患者及家屬知情同意并自愿參與。排除標準：①妊娠前糖耐量異常，且孕前已經(jīng)明確診斷糖尿病者；②合并妊娠期高血壓、多囊卵巢綜合征、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾??；③合并妊娠期急性心臟病、腎病者；④依從性差，無法配合完成研究者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1樣本采集收集孕婦空腹靜脈血離心取上清，-80℃保存待測。

1.2.2血清miR-200a、miR-34a檢測用RNAeasy extraction Kit(Qiagen公司)提取血清RNA，以Nanodrop2000(Thermo 公司生產(chǎn))測定RNA濃度及純度。采用定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)將2 μg 完整無降解RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考SYBR Green PCR master mix試劑盒(大連寶生物公司)說明書加配熒光定量PCR反應體系，每個樣品設置3次重復，熒光定量PCR體系加配完成后，放入BioRad CFX定量PCR儀進行熒光定量PCR反應。反應結(jié)束后收集實驗數(shù)據(jù)，miR-200a、miR-34a以U6為內(nèi)參基因(引物序列見表1)，采用2-ΔΔCt算法計算血清中miR-200a、miR-34a相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3血糖及胰島素水平檢測OGTT實驗前，分別取孕婦外周靜脈血，口服糖后取1h、2h時外周靜脈血，采用Cobase601全自動電化學發(fā)光分析儀(羅氏公司)分別檢測FINS、FPG及OGTT實驗各點血糖，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料

統(tǒng)計兩組入組時年齡、孕周、身高、體重、家族糖尿病史等臨床資料，比較均無差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-200a、miR34a表達

GDM組血清miR-200a(1.63±0.25)、miR-34a(1.43±0.21)表達水平均高于NGT組(1.02±0.19、1.04±0.18)(P<0.001)。

2.3 兩組GDM相關指標

GDM組OGTT實驗后1hPG、2hPG、FPG、FINS和HOMA-IR水平均高于NGT組(P<0.001)。見表3。

表3 兩組GDM相關指標比較

2.4 影響GDM患者HOMA-IR因素

多元線性回歸分析結(jié)果顯示，miR-200a、miR-34a、1hPG、2hPG等4項因素進入回歸方程?；貧w方程的復相關系數(shù)R=0.713，決定系數(shù)R2=0.782?；貧w方程顯著性檢驗：F=37.62，P<0.001，回歸方程線性關系顯著。見表4。

表4 影響GDM患者HOMA-IR因素的多元線性回歸分析

2.5 GDM患者血清miR-200a、miR-34a表達與HAMA-IR相關性

Pearson相關性分析結(jié)果顯示，GDM患者血清miR-34a、miR-200a均與HOMA-IR呈正相關(r=0.623,P<0.001)(r=0.792,P<0.001)。見圖1。

圖1 GDM患者血清miR-200a、miR-34a表達水平與HAMA-IR相關性分析

2.6 影響GDM發(fā)生的危險因素

logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-34a、miR-200a、HOMA-IR均是GDM發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響GDM發(fā)生的危險因素logistic回歸分析

3 討論

GDM是妊娠期常見的合并癥之一，但發(fā)病機制尚不清楚。有研究認為高齡產(chǎn)婦、肥胖、體重過大、多囊卵巢綜合征、糖尿病前期、糖尿病家族史、巨大兒史等均可能影響GDM發(fā)生[1]。本研究兩組孕婦年齡、孕周、身高、體重、BMI、糖尿病史等比較并未見差異，提示可能以上因素與GDM發(fā)生無直接相關性。最近有研究者認為IR是GDM發(fā)病主要原因，與2型糖尿病發(fā)病基礎類似[3]。妊娠后孕婦胎盤分泌雌激素、孕酮、人胎盤泌乳素等抵抗胰島素活性增加，降低胰島素的敏感性，導致孕婦出現(xiàn)生理性胰島素抵抗狀態(tài)[7]；另胎盤產(chǎn)生的胰島素酶，加快了胰島素降解失活，胰島素水平不足以調(diào)節(jié)血糖代謝時影響孕婦體內(nèi)糖代謝，最終導致GDM發(fā)生[8]。因此，探究影響IR發(fā)生的機制對GDM診斷、治療有重要意義。

miRNA在細胞生長、細胞凋亡、疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，與糖尿病發(fā)生關系是目前臨床研究熱點。Zhu等研究表明，miR-29a、miR-34a、miR-375、miR-103等與2型糖尿病發(fā)病有關[9]，提示糖尿病的發(fā)生可能與以上多種miRNA表達失常有關。已有研究表明miR-34a在2型糖尿病患者外周血中表達上調(diào)，可作為2型糖尿病患者潛在生物指標[6]。IR是GDM和2型糖尿病共同的發(fā)病基礎[10]，提示miR-34a可能參與了GDM發(fā)病過程。miR-200家族成員miR-200a通過影響胰島β細胞凋亡參與2型糖尿病患者發(fā)病過程[11]。本研究結(jié)果顯示，miR-200a、miR-34a在GDM患者血清中表達高于NGT組，與miR-200a在GDM外周血和miR-34a在2型糖尿病患者血清中表達趨勢一致[4-5]。提示miR-200a、miR34a可能通過調(diào)控血糖代謝基因或胰島素相關調(diào)控基因表達參與糖尿病發(fā)生過程，兩種調(diào)控方式均會引起血糖的變化。

OGTT實驗是臨床上診斷糖尿病的通用方法[12]。本研究GDM組1hPG、2hPG水平高于NGT孕婦，提示1hPG、2hPG高水平是GDM重要特征，而這一特征可能與IR有關。IR是GDM最重要的發(fā)病機制之一[3]。本研究結(jié)果顯示GDM組HOMA-IR水平高于NGT組，提示HOMA-IR水平可能影響GDM發(fā)病過程。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，miR-34a、miR-200a、1hPG、2hPG是GDM發(fā)生HOMA-IR相關因素，提示miR-200a、miR34a表達水平可能影響了GDM患者胰島素抵抗程度。Guo等研究表明，miR-200a通過調(diào)控Rheb改善十二指腸空腸旁路術后的胰島素抑制[13]，表明miR-200a可能調(diào)控Rheb而參與GDM患者IR過程。在2型糖尿病患者中miR-34a參與了胰島β凋亡促進IR[15]，推測miR-34a上調(diào)表達影響胰島β細胞凋亡參與IR。Pearson相關性分析結(jié)果顯示，HOMA-IR水平與miR-200a、miR-34a表達水平均呈正相關，提示血清miR-200a、miR-34a可能作為IR程度的參考指標?；貧w分析結(jié)果顯示，miR-34a、miR-200a、HOMA-IR等均是GDM發(fā)生的影響因素，表明miR-200a、miR-34a上調(diào)表達可能促進了HOMA-IR水平升高，導致GDM發(fā)生。

綜上所述，血清miR-34a、miR-200a在GDM患者中表達上調(diào)，與HOMA-IR水平呈正相關，血清miR-34a、miR-200a、HOMA-IR是影響GDM發(fā)生的危險因素。但miR-200a、miR-34a與IR發(fā)生及GDM發(fā)病具體機制還有待進一步研究。