孕產婦宮頸病變篩查中高危HPVE6/E7mRNA與HPV DNA檢測的臨床價值

歐鳳柳 胡艷麗 秦 永

重慶市黔江中心醫(yī)院(409000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見且高發(fā)的惡性腫瘤，我國每年新增宮頸癌患者約13萬例[1～2]。大量研究顯示人乳頭瘤病毒(HPV)感染，特別是高危型HPV感染是大部分宮頸癌前病變及宮頸癌的主要原因[3～4]。臨床資料顯示，HPV好發(fā)于育齡期女性，且妊娠期婦女HPV感染的風險高于非妊娠期婦女[5]。目前臨床只有較少感染進展為惡性病變，而進展為惡性病變則需要整合HPV基因組中E6、E7基因的過表達[6]?？梢奅6與E7基因轉錄是病變進展的一項重要標志。臨床對HPV的篩查主要基于DNA檢測，而通過監(jiān)測E6、E7基因的表達可成為另一選擇。本研究通過比較高危HPV E6/E7 mRNA以及HPV DNA檢測方法，評價兩種檢測方法在孕產婦宮頸病變篩查中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月—2019年6月在本院接受治療有宮頸病變的孕產婦64例，年齡(28.2±6.3)歲(21～47歲)，孕(17.8±3.1)周(10～36周)，在檢查前1年內均未進行過宮頸篩查。排除患有血液系統(tǒng)疾病、習慣性流產、前置胎盤、胎膜早破等并發(fā)癥者。在產檢時進行宮頸脫落細胞學檢查，納入患者均通過陰道鏡下活檢以及盆腔體檢，提示為不典型鱗狀細胞、宮頸上皮內瘤樣變、鱗狀細胞癌，最終經(jīng)過組織病理學診斷為宮頸疾病。其中慢性宮頸炎26例，CIN 27例，宮頸癌11例。將宮頸炎癥與CINⅠ患者做為低級別組，其余患者為高級別組。本研究獲得本院倫理委員會批準后進行。

1.2 檢查方法

所有患者均先行宮頸液基細胞學(TCT)檢測，提示為不典型鱗狀細胞、宮頸上皮內瘤樣變、鱗狀細胞癌。再行HPV DNA分型檢測以及HPVE6/E7mRNA檢測。分別采集每位患者宮頸標本2份，放入相對應取樣管中。

1.2.1HPVDNA分型檢測標本離心棄上清液，行DNA提取。配置PCR反應體系，每份樣本PCR Mixl9.25μl， DNA Taq酶0.75μl，超純水40μl，加入待測樣本1μl，二者充分混合后進行PCR擴增。保持溫度36℃，加入500μl BT/BCIP底物顯色劑，避光反應5min后顯色，顯示結束后使用1ml溶液B 3次洗膜，使用2ml蒸餾水漂洗，在顯色后60min內觀察并分析檢測結果。肉眼進行判斷，若出現(xiàn)清晰可見的藍紫色圓點則為陽性點，一個圓點則為HPV亞型單一感染，≥2個則為多重感染。

1.2.2高危HPVE6/E7mRNA檢測標本離心棄上清液，在沉淀細胞團中加入200μl裂解液與400μl DDH2O，混合后再加入5μl蛋白酶K， 65℃孵育60min。配置空白以及陽性質控緩沖液2份，每份98 μl，標本反應體系50μl。使用含特殊捕獲探針的96孔板常溫復溫后，進行雜交捕獲mRNA。按照3:1000的比列配置底物催化劑與底物的混合液，將96孔板取出，棄置標記探針混合液，IX洗脫液洗板3次，每次200μl，每孔加入混合液100μl，封板后置于46℃恒溫箱反應20min后判斷結果。通過計算轉換后自動判斷。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19統(tǒng)計處理，對兩種方法檢出率進行兩兩χ2比較，一致性采用Kappa值衡量，其靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值比較采用χ2檢驗，當P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同方法檢測宮頸病變檢出情況

兩種檢測方法檢出宮頸慢性炎癥、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ以及宮頸癌陽性率無差異(P>0.05)。見表1。

表1 宮頸各類病變兩種指標陽性檢出情況比較[例(%)]

2.2 兩種方法檢出一致性分析

隨著宮頸病變程度加重，兩種檢測指標陽性檢出的一致性逐漸增加。見表2。

表2 兩種不同檢測指標一致性比較(例)

2.3 高級別宮頸病變中兩種檢測指標效能

HPV DNA檢測的特異性低于HPVE6/E7mRNA檢測(P<0.05)，敏感性、陽性預測值及陰性預測值兩種檢測指標無差異(P>0.05)。見表3。

表3 高級別宮頸病變中兩種檢測指標效能比較(%)

3 討論

HPV與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關，特別是高危型HPV[7]。激素變化會直接影響孕產婦生殖道內環(huán)境以及免疫抑制，感染普遍為潛伏隱匿性，臨床癥狀不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期孕婦的盆腔、生殖器血管相對豐富，雌激素、孕激素水平上升，機體免疫力下降；母體血漿產生大量巨球蛋白，抑制淋巴細胞轉化增加了HPV感染率[8～9]。妊娠合并HPV感染與多種不良妊娠結局相關，對孕產婦進行宮頸病變的篩查具有重要臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，從感染HPV進展為宮頸癌需要較長時間，而病變的進展與HPV癌基因的過表達有關[10]。E6、E7蛋白持續(xù)表達在宮頸組織惡化中有重要作用[11]。目前臨床普遍使用HPV DNA檢測篩查宮頸癌病變，但90%的HPV感染者能夠在半年～2年內自行清除，只有持續(xù)性高危型HPV感染會發(fā)展為癌癥[12]?？梢?，暫時性的感染能夠通過HPV DNA檢出，但對預測宮頸病變風險意義并不顯著。臨床已證實在宮頸癌致癌機制中E6、E7癌蛋白具有重要作用，鑒于此本文對宮頸疾病患者進行HPV E6/E7 mRNA檢測分析。

本研究結果顯示，HPV E6/E7 mRNA檢出宮頸病變類型與HPV DNA相似未見差異，但對低級別宮頸病變，HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢出略有不同。對此筆者認為， HPV E6/E7 mRNA過低的檢出率，反映出此時E6、E7水平呈現(xiàn)低水平或缺乏轉錄活性，感染的高危型HPV病毒大部分可自行清除，從而避免了臨床過度檢測及治療，也緩解了患者心理及經(jīng)濟壓力。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在高級別宮頸病變患者中具有高E6/E7mRNA轉錄水平，此時高危HPV病毒已整合到宿主基因組，造成HPV E6和E7兩種病毒癌蛋白的表達升高，表明E6/E7基因的過度表達是惡性轉化、維持和發(fā)展的必要條件[13～15]。本研究分析兩種檢測方法的一致性，其差異主要體現(xiàn)在炎癥以及低級別宮頸病變，而在部分HPV DNA檢測判斷為高危HPV感染的患者中并未檢出E6/E7 mRNA表達。此外，本研究結果顯示，HPVE6/E7mRNA檢測的特異性高于HPV DNA檢測，說明HPV E6/E7 mRNA能夠在早期檢測發(fā)現(xiàn)有進展風險的持續(xù)性感染，同時可識別可能消退的病變。

綜上所述，相比HPV NDA檢測，HPVE6/E7mRNA檢測能更好地預測孕產婦宮頸病變進展，針對高級別宮頸病變具有更強的特異性。但因本研究樣本較少，且選取對象均為宮頸病變的孕產婦，可能與實際具有一定偏差，還需深入觀察與研究。