Elabela/APJ信號通路對子癇前期大鼠胎盤血管生成的影響

華詔召 李大娜 吳安芹 曹 婷 羅 實(shí)

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(貴陽，550003)

子癇前期(PE)是一種以妊娠20周后新發(fā)高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯娜硇匝芗膊?，以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鱗1]。子癇前期是胎盤缺血性疾病，是由于子宮-胎盤血液循環(huán)障礙和胎盤功能缺陷，導(dǎo)致持續(xù)性胎盤缺氧而引發(fā)母體各種疾病表現(xiàn)[2]。G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，具有重要的生理功能，而Elabela是APJ的一個新的內(nèi)源性肽類配體。Elabela可以促進(jìn)血管生成，結(jié)合并激動APJ后進(jìn)一步指引成血管系統(tǒng)發(fā)育成熟的基礎(chǔ)[3]。降低子宮灌注壓是通過手術(shù)使供應(yīng)胎盤的血管狹窄，減少胎盤血供，接近PE的病理發(fā)生過程，是目前應(yīng)用較廣泛的一種模型，能成功模擬妊娠期高血壓、蛋白尿等病理變化[4]。因此，本研究利用降低子宮灌注壓建立子癇前期大鼠模型，探討Elabela/APJ信號通路在子癇前期大鼠胎盤血管生成中的作用，為深入了解子癲前期的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及試劑選擇雌性SD大鼠20只，8～12周，體重200～220 g；雄性SD大鼠10只，體重280～300 g；購自中國科學(xué)院昆明動物研究所，合格證號：SCXK(滇)K2016-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑戊巴比妥鈉(北京華業(yè)寰宇化工有限公司)、RIPA裂解液、DAB顯色試劑盒(均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、Trizol(Invitrogen公司)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、人胚胎生長因子(PLGF)、β-actin普通PCR上下游引物(上海生工公司)、VEGF兔單克隆抗體、PLGF兔多克隆抗體、APJ兔多克隆抗體(美國Abcam)、Elabela兔單克隆抗體(Phoenix Biotech)、山羊抗兔二抗(美國LI-COR公司)、微量白蛋白ELISA試劑盒、肌酐(南京建成生物工程研究所)。

1.2 建立動物模型及分組

將SD雌鼠和雄鼠1:2合籠，次日早晨查見陰栓定為妊娠第1天。將受孕的16只雌鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。合籠見栓后第14天，吸入異氟烷麻醉，沿中下腹正中線逐層切開腹腔至暴露并剝離出腹主動脈下端分支子宮動脈，于兩側(cè)子宮動脈置U形銀夾，縫合切口，完成模型的建立[4]。假手術(shù)組僅分離腹主動脈與雙側(cè)子宮動脈，不置U形銀夾，縫合切口。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1手術(shù)前后大鼠血壓采用BP-2000血壓分析系統(tǒng)檢測大鼠手術(shù)前后血壓[5]。將大鼠固定于籠內(nèi)加熱袋，溫度38℃預(yù)熱10 min后，將鼠尾穿過加壓感應(yīng)器，固定于鼠尾根部。使大鼠尾動脈與加壓感應(yīng)器緊密接觸，觀察血壓測量系統(tǒng)波形，波形穩(wěn)定后測量血壓。檢測術(shù)前1d，術(shù)后1，7d大鼠血壓，每次重復(fù)測量6次，測出收縮壓和舒張壓，獲得平均動脈壓，平均動脈壓=(收縮壓+舒張壓×2)/3。

1.3.2手術(shù)前后大鼠尿蛋白含量測量血壓同時收取大鼠瞬時尿液樣本，分別使用尿白蛋白ELISA試劑盒和肌酐檢測試劑盒進(jìn)行尿白蛋白和尿肌酐測定。將尿白蛋白與尿肌酐的比值作為蛋白尿的判斷標(biāo)準(zhǔn)。分別測定兩組大鼠術(shù)前1d、手術(shù)后1，7d的尿微量白蛋白/肌酐比值。

1.3.3胎鼠、胎盤體質(zhì)量檢測孕21 d時戊巴比妥鈉麻醉后剖腹取胎，檢測胎鼠體和胎盤質(zhì)量。盡快分離胎盤組織，液氮速凍，-80℃保存待用。

1.3.4大鼠胎盤Elabela、APJ、VEGF、PLGF的蛋白表達(dá)水平取胎盤加入RIPA 裂解液裂解后提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每組按50 μg蛋白上樣量經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后加入一抗(1:1500稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:5000稀釋)，室溫孵育1 h后TBST洗膜。隨后使用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，于暗室成像拍照，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J分析軟件計(jì)算各組大鼠胎盤中Elabela、APJ、VEGF、PLGF的蛋白表達(dá)水平。

1.3.5檢測胎盤內(nèi)VEGF、PLGF的mRNA表達(dá)水平Trizol法提取胎盤組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR方法檢測各組VEGF、PLGF基因的表達(dá)水平。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物設(shè)計(jì)：VEGF上游5'-CCAGGAGTACCCCGATGAGATAG-3'，下游5'-CTGGCTTTGGTGA-GGTTGATC-3'；PLGF上游5'-ACGTGGAGCTGACGTTCTCT-3'，下游5'-CAGCAGGAGTCA-CTGAAGAG-3’；β-actin上游5'-ACCCCGTGCTGCTGCTGACCGAG-3'，下游5'-TCCCGGCC-AGCCAGCCAGGTCCAT-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60 ℃退火30s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。每組VEGF、PLGF基因的相對表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓

模型組與假手術(shù)組孕鼠均無死亡。與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后1d收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著升高(t=8.839，P<0.05；t=8.955，P<0.05；t=10.847，P<0.05)，術(shù)后7d也顯著升高(t=27.332、16.266、23.681，均P<0.05)；而術(shù)前兩組大鼠收縮壓、舒張壓及平均動脈壓無差異(P>0.05)。與術(shù)前1天相比，模型組大鼠術(shù)后1d收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均升高(t=9.248、11.225、14.481，均P<0.05)；術(shù)后7d升高(t=24.241、17.044、26.274，均P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠手術(shù)前后血壓比較

2.2 大鼠尿蛋白含量

與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后1d的尿白蛋白、尿白蛋白/尿肌酐比值均顯著升高(t=51.386、17.131，均P<0.05)；術(shù)后7d也顯著升高(t=52.819、28.282，均P<0.05)，而術(shù)前兩組無差異(P>0.05)。與術(shù)前1天相比，模型組術(shù)后1d尿白蛋白、尿白蛋白/尿肌酐比值顯著升高(t=43.743、17.330，均P<0.05)；術(shù)后7d也顯著升高(t=60.238、27.294，均P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠手術(shù)前后尿蛋白含量比較

2.3 胎鼠體質(zhì)量及胎盤重量

模型組孕鼠死胎率高于假手術(shù)組(χ2=22.442，P<0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均顯著降低(t=11.606、8.832，均P<0.05)。見表3。

表3 兩組妊娠大鼠胎鼠體質(zhì)量及胎盤重量

2.4 胎盤組織Elabela、APJ的蛋白表達(dá)水平

大鼠胎盤內(nèi)Elabela、APJ的蛋白表達(dá)水平，與假手術(shù)組(1.00±0.10，0.96±0.09)相比，模型組(0.30±0.03，0.21±0.02)均顯著降低(t=11.984、14.078，均P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠胎盤組織Elabela、APJ蛋白表達(dá)

2.5 胎盤組織VEGF、PLGF的表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胎盤組織VEGF、PLGF的蛋白表達(dá)水平顯著降低(t=12.217、14.039，均P<0.05)，VEGF mRNA、PLGF mRNA表達(dá)水平顯著降低(t=16.374、12.064，均P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 兩組大鼠胎盤組織VEGF、PLGF蛋白表達(dá)

表4 兩組妊娠大鼠胎盤組織VEGF、PLGF蛋白和mRNA表達(dá)水平

3 討論

子癇前期是一種多系統(tǒng)代謝性疾病，常伴有高血壓和蛋白尿，是世界范圍內(nèi)孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的重要原因之一[6]。目前，子癇前期的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，構(gòu)建理想的子癇前期動物模型可為相關(guān)研究提供良好的基礎(chǔ)[7]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)，通過降低子宮灌注壓建立子癇前期大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后1，7d的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及尿白蛋白/尿肌酐比值均顯著升高，與本組術(shù)前1d相比，術(shù)后1，7d均顯著升高，提示本研究子癇前期大鼠模型建立成功。進(jìn)一步檢測胎鼠體質(zhì)量及胎盤重量，發(fā)現(xiàn)模型組孕鼠死胎率高于假手術(shù)組，提示子癇前期孕鼠的胚胎發(fā)育不完全可能是造成母體損傷、胎鼠死胎率高且體質(zhì)量降低的原因之一。

Elabela是APJ的內(nèi)源性配體，是胎盤分泌的一種循環(huán)激素。Elabela基因敲除的妊娠小鼠表現(xiàn)出子癇前期樣癥狀，包括蛋白尿和由于胎盤血管生成缺陷而升高的血壓[8]。Elabela/APJ軸可能通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶表達(dá)和致病性血管緊張素II信號，保護(hù)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭[9]。研究報道，Elabela/APJ信號通路也可通過cAMP信號通路和ERK信號通路改變細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)從而促進(jìn)血管生成[10]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Elabela/APJ軸有助于胚胎發(fā)育，Elabela可激活A(yù)PJ信號通路，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，使小鼠主動脈血管松弛，其可以通過降低妊娠期血壓和蛋白尿水平預(yù)防子癇前期；但Elabela缺陷可導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胎盤內(nèi)Elabela、APJ的蛋白表達(dá)水平均顯著降低。提示Elabela、APJ表達(dá)減少，Elabela/APJ信號通路功能被抑制，可能參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展。VEGF是一種重要的促血管生成因子，具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂原，在刺激新血管的發(fā)生、生長及維持血管壁的完整性和通透性具有重要作用。如果血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)減少，則會影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和分化，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的功能被抑制[13]。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤組織中VEGF水平較對照組顯著降低，且隨著病情的加重，VEGF表達(dá)水平逐漸降低，其在子癇發(fā)生以及病情演變中發(fā)揮重要作用[14]。PLGF屬于血管內(nèi)皮生長因子中的一種，是調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的重要物質(zhì)，在早孕期對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與分化具有促進(jìn)作用，確保胎盤血管網(wǎng)絡(luò)形成充分[15]。有研究報道，孕婦血清中PLGF濃度與子癇前期的發(fā)病具有相關(guān)性，對子癇前期的發(fā)生具有良好的預(yù)測價值[16]。黃鳳鳳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦血清PLGF水平顯著降低，且病情嚴(yán)重者PLGF水平下降更明顯。Ho等[18]用Elabela刺激人胚胎干細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)的表達(dá)增加，能夠促使Smads磷酸化并與其他轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成[19]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胎盤組織VEGF、PLGF的蛋白表達(dá)水平及其mRNA表達(dá)水平均顯著降低。提示子癇前期孕鼠胎盤組織中VEGF及PLGF的表達(dá)降低導(dǎo)致血管生成異常，進(jìn)一步促進(jìn)子癇前期的發(fā)展。其可能與Elabela/APJ信號通路被抑制有關(guān)。

綜上所述，子癇前期孕鼠胎盤組織內(nèi)Elabela、APJ表達(dá)減少，Elabela/APJ信號通路功能被抑制，其可能通過抑制VEGF及PLGF在胎盤中的表達(dá)參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。但Elabela/APJ信號通路如何調(diào)控VEGF及PLGF的表達(dá)及其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。