血管生成因子A抑制劑對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

張忠元 易 蕾 楊曉艷

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院(430060)

子宮內(nèi)膜異位癥主要是由活性內(nèi)膜細(xì)胞在機(jī)體子宮內(nèi)膜之外種植而導(dǎo)致[1]。臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)異常、尿頻腹瀉等，對患者生育能力和妊娠造成嚴(yán)重影響[2]。目前發(fā)病機(jī)制尚未明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與血管生成及充足的血供有密切聯(lián)系，抗血管生成是治療子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)鍵[3-4]。血管生成因子(VEGF)家族中VEGF-A，在血管生成過程中發(fā)揮著重要作用。目前國內(nèi)外關(guān)于靶向VEGF-A對子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行干預(yù)研究鮮有報道，本文研究建立了子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，使用VEGF-A抑制劑進(jìn)行干預(yù)，探究對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究動物選取35只SD健康雌性大鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，鼠齡(5.8±1.5)月(4～8月)，體重(231.5±15.7)g(210～250g)；均養(yǎng)殖在干凈籠里，室溫23.1±1.8℃，相對濕度35%～40%，每天光照12h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)1周。本文研究實驗均獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑大鼠抗小鼠雌激素(E2)、孕酮(P)抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)抗體(Sigma公司)；大鼠抗兔VEGF、HIF-1α抗體(Dako公司)；兔抗大鼠CRP、IL-8、IL-6抗體(Selleck公司)；兔抗大鼠Bcl-2、Bax抗體(Gibco公司)；兔抗小鼠caspase3抗體(Hyclone公司)。

1.2 建模及分組

隨機(jī)取5只大鼠不做任何處理作正常組，余30只大鼠建立子宮內(nèi)膜異位癥模型：對大鼠注射苯甲酸雌二醇使其發(fā)情，麻醉處理后固定，腹部備皮消毒，在尿道口上方10mm做一2cm垂直切口開腹，顯露膀胱下子宮組織，近端于距宮角10mm處位置結(jié)扎，遠(yuǎn)端距卵巢20mm位置結(jié)扎，摘除子宮并使用磷酸鹽緩沖液清洗，子宮切開后剝除漿膜層、肌層，將子宮內(nèi)膜切成4mm×4mm大小植入大鼠皮下筋膜與腹肌之間后關(guān)腹。喂養(yǎng)20d后再次開腹觀察異位內(nèi)膜組織生長情況。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：移植物囊性增大，囊壁出現(xiàn)新生結(jié)締組織和血管，囊泡中出現(xiàn)黃色液體。最終建模成功28只，將28只子宮內(nèi)膜異位癥大鼠隨機(jī)分為模型組10只以及丹那唑組、VEGF-A抑制劑組各9只，丹那唑組大鼠使用丹那唑溶液灌胃處理，VEGF-A抑制劑組大鼠使用VEGF-A抑制劑灌胃處理，正常組、模型組大鼠使用生理鹽水灌胃處理。禁食5h后取所有大鼠尾部靜脈血清，-70℃保存待檢。各組大鼠發(fā)情期麻醉斷頭法處死，摘取正常組大鼠左側(cè)子宮及子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜組織，液氮冷凍后甲醛浸泡固定行組織切片，免疫組化染色。

1.3 激素測定

免疫透射比濁法檢測各組血清E2、P、FSH、LH水平，波長340～700nm處讀吸光度并計算。酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清CRP、IL-8、IL-6水平，按照試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書檢測。

1.4 蛋白表達(dá)

使用Western blot法檢測。PBS緩沖液清洗內(nèi)膜組織標(biāo)本3次，分離緩沖液后裂解0.5h，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液后電泳10 min，在10%牛奶中浸泡電轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1.5 h；與一抗結(jié)合之后使用TBST稀釋并孵育保存；次日使用TBST液清洗，與二抗結(jié)合后常溫孵育1 h，再次清洗，加入顯影劑顯色，檢測VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Bax、caspase3相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清性激素水平對比

大鼠血清E2、P、FSH、LH水平，正常組<丹那唑組

表1 各組大鼠血清性激素水平對比

2.2 各組大鼠血清因子水平對比

大鼠血清CRP、IL-8、IL-6水平，模型組最高，正常組最低，VEGF-A抑制劑組低于丹那唑組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清因子水平對比

2.3 各組大鼠VEGF、HIF-1α相對表達(dá)量對比

如表3、圖1(見封三)、圖2(見封三)所示，VEGF、HIF-1α相對表達(dá)量模型組高于正常組；丹那唑組、VEGF-A抑制劑低于模型組，且VEGF-A抑制劑組低于丹那唑組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠內(nèi)膜組織中蛋白相對表達(dá)量對比

如表4所示， Bcl-2、caspase3相對表達(dá)量模型組高于正常組，Bax相對表達(dá)量低于正常組(P<0.05)。丹那唑組、VEGF-A抑制劑組Bcl-2、caspase3相對表達(dá)量均低于模型組，Bax相對表達(dá)量高于模型組，且VEGF-A抑制劑組Bcl-2、caspase3相對表達(dá)量低于丹那唑組，Bax相對表達(dá)量高于丹那唑組(均P<0.05)。

表3 各組大鼠VEGF、HIF-1α相對表達(dá)量對比

表4 各組大鼠內(nèi)膜組織中蛋白相對表達(dá)量對比

3 討論

雌激素水平的變化與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展、異位內(nèi)膜組織的生長密切相關(guān)[5]，是內(nèi)分泌失調(diào)重要的檢測指標(biāo)[6]。P具有保護(hù)子宮內(nèi)膜作用[7]。FSH對卵巢發(fā)育起到促進(jìn)作用[8]。LH能引起排卵并生成黃體[9]。本文研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠E2、P、FSH、LH水平均異常上升，藥物干預(yù)后明顯下降。分析原因可能是使用VEGF-A抑制劑干預(yù)，促進(jìn)大鼠異位子宮內(nèi)膜組織的生長，使E2、P、FSH、LH水平下降。

研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著炎癥反應(yīng)[10]。CRP在人機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)、腫瘤以及組織損傷時呈現(xiàn)高表達(dá)，屬急性期反應(yīng)物，臨床常被用作檢測炎性反應(yīng)以及免疫防御功能的標(biāo)志物[11]。魏順英[12]等研究，CRP在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，與子宮內(nèi)膜異位癥的病情發(fā)展及嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。IL-8可激活中性粒細(xì)胞，并釋放一系列活性產(chǎn)物，導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷目的[13]。IL-6參與多種炎癥反應(yīng)和疾病，是一種重要的促炎因子，還能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，并提高其免疫功能。有研究表明，隨著人體健康程度提升，IL-6在人體水平會出現(xiàn)一定程度下降[14]。朱定軍[15]等研究認(rèn)為，IL-8、IL-6與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其水平對異位癥診斷和療效評價具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠CRP、IL-8、IL-6水平較高，使用VEGF-A抑制劑干預(yù)后出現(xiàn)明顯下降，說明炎癥反應(yīng)減輕。分析原因可能是抑制劑抑制了異位內(nèi)膜組織的炎癥發(fā)展，從而減輕炎癥反應(yīng)。

VEGF、HIF-1α與機(jī)體組織血管生成具有密切聯(lián)系。HIF-1α大量存在于哺乳動物細(xì)胞中[16]。VEGF具有提升機(jī)體血管通透性、促進(jìn)機(jī)體血管形成作用[17]。本文研究結(jié)果顯示，使用VEGF-A抑制劑對大鼠異位內(nèi)膜組織VEGF、HIF-1α表達(dá)明顯抑制，說明抑制了VEGF、HIF-1α的表達(dá)，抑制了異位內(nèi)膜組織的血管生成，從而起到干預(yù)效果。

有學(xué)者在研究中表示，促進(jìn)異位內(nèi)膜組織凋亡是治療子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)鍵[18]。Bcl-2、Bax、caspase3的表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[19]。有學(xué)者研究，caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，caspase3是caspase家族的重要一員，是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[20]。本文研究結(jié)果顯示，使用VEGF-A抑制劑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠干預(yù)，Bcl-2、caspase3表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，Bax表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，說明通過調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase3表達(dá)，促進(jìn)了異位內(nèi)膜組織的凋亡。

綜上所述，使用VEGF-A抑制劑對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠干預(yù)，能夠調(diào)控性激素分泌，抑制炎癥反應(yīng)和異位內(nèi)膜組織生長，促進(jìn)異位內(nèi)膜組織凋亡。