氯氨酮通過抑制炎癥因子表達(dá)保護(hù)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞功能①

劉 宇 李 耀 萬永靈

(四川省人民醫(yī)院麻醉科，成都610031)

膿毒癥是一種因患者全身出現(xiàn)的惡性炎癥反應(yīng)，主要由于各種感染、創(chuàng)傷、外科手術(shù)等反復(fù)刺激導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子產(chǎn)生的疾病，患者病情多變且不穩(wěn)定，容易合并急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)或心肌細(xì)胞凋亡等，隨著病情的發(fā)展可能會出現(xiàn)多器官功能衰竭[1,2]。氯氨酮又稱凱他敏、鹽酸氯胺酮，是一種靜脈全麻藥[3,4]。目前主要用于各種小手術(shù)或診斷操作時的麻醉，研究表明，氯氨酮與大鼠心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[5]。本文旨在探究氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡、免疫功能紊亂及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，以期了解氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡、免疫功能紊亂以及Bax、Bcl-2表達(dá)的作用機(jī)制，為膿毒癥患者的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級3周齡SD大鼠75只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：粵監(jiān)證字 2004A029，于15個籠中飼養(yǎng)，5只/籠。所有大鼠均在本院動物中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 蘇木素、伊紅購自武漢博士德生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α試劑盒購自美國Sigma 公司；肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)，肌紅蛋白(Myoglobin,Mb) 和肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；Bcl-2、Bax抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；Caspase-3抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司；TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司；SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司。

1.1.3儀器 TDL-5 型臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2方法

1.2.1建立模型 將75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)選15只為正常對照組，其余60只大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法建立中度膿毒癥模型，制作方法及判斷模型是否成功參考文獻(xiàn)[6]。具體操作如下：戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿腹做切口，取出大鼠盲腸后線結(jié)扎50%近端盲腸，并使用18號針頭穿孔盲腸2次，兩針孔相距約2 mm，擠出少量糞便后將其放回腹腔，逐層關(guān)腹，消毒。

1.2.2分組及藥物干預(yù) 將75只大鼠隨機(jī)平均分為5組，每組15只，分別為：空白對照組(Control)、誘導(dǎo)模型組(CLP)、低濃度氯胺酮組(Ketamine 10 mg/kg)、中濃度氯胺酮組(Ketamine 20 mg/kg)、高濃度氯胺酮組(Ketamine 40 mg/kg)。氯胺酮處理的各組大鼠分別在模型制備成功后15 min按照上述濃度肌肉注射氯胺酮，空白對照組和誘導(dǎo)模型組分別注射等量生理鹽水，氯胺酮處理4 h后處死大鼠。

1.2.3HE染色觀察大鼠心臟的病理損傷情況 多聚甲醛固定大鼠組織后石蠟保存，制成組織切片，使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度入水，PBS浸洗后浸入蘇木素染色3～5 min，水洗，再使用酸水和氨水分別浸潤、水洗；最后置于伊紅染色2 min，洗去多余染液，濾紙吸干，迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察染色情況并分析。

1.2.4ELISA 從大鼠頸總動脈插管接取0.5 ml血液，分別按IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK的試劑盒說明書檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK含量。

1.2.5Western blot 取大鼠心臟組織提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各自需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，顯色液顯色后檢測吸光度，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6免疫組化 對石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，過氧化氫甲醇液室溫浸泡15 min并使用胃蛋白酶消化，滴加一抗，Caspase-3置于濕盒中恒溫冰箱保存過夜，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育60 min后PBS清洗，顯色后蘇木素復(fù)染1 min脫水并封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7RT-PCR TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增，SYBR PCR Master Mix試劑盒檢測Bax和Bcl-2表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析和作圖分別采用SPSS 22.0和GraphPad Prism5軟件，方差分析使用單因素方差分析，當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義時，采用SNK方法進(jìn)行進(jìn)一步比較；以P<0.05為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心臟病理損傷觀察結(jié)果 對照組大鼠心肌組織正常，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；心肌纖維完整，肌細(xì)胞核大小形態(tài)未見異常，肌纖維縱切面可見周期性明暗相間橫紋，其余未見異常；誘導(dǎo)模型組大鼠心肌的鏡下部分肌纖維彎曲，部分肌紅蛋白溶解，肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；低濃度氯胺酮組大鼠心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲，其余未見異常；中、低濃度氯胺酮組大鼠心肌組織基本正常，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細(xì)胞核大小形態(tài)未見異常，肌纖維縱切面可見明暗相間周期性橫紋；高、低濃度氯胺酮組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲，其余未見異常。見圖1。

2.2各組大鼠血清中心損標(biāo)記物檢測 由圖2可知，相比對照組，誘導(dǎo)模型組大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比誘導(dǎo)模型組，氯胺酮處理各組大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。

2.3各組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá) 由圖3可知，相比對照組，誘導(dǎo)模型組大鼠Caspase-3蛋白表達(dá)水平及Caspase-3陽性細(xì)胞百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比誘導(dǎo)模型組，使用氯胺酮處理各組大鼠Caspase-3蛋白表達(dá)水平及Caspase-3陽性細(xì)胞百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。

圖1 各組大鼠心臟病理損傷觀察結(jié)果(×400)Fig.1 Observation results of cardiac pathological dama-ges of rats in each group(×400)

圖2 各組大鼠血清損傷標(biāo)記物檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of heart damage markers in rats serum of each groupNote: Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

圖3 各組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)

2.4各組大鼠外周血中炎癥因子檢測結(jié)果 由圖4可知，相比對照組，誘導(dǎo)模型組大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高，IL-10水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比誘導(dǎo)模型組，氯胺酮處理各組大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，IL-10水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。

圖4 各組大鼠外周血中炎癥因子檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of inflammatory factors in rats peripheral blood of each groupNote: Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

圖5 各組大鼠Bax、Bcl-2基因表達(dá)檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of Bax and Bcl-2 gene expression in rats of each groupNote: 1.Control；2.CLP；3.Ketamine 10 mg/kg；4.Ketamine 20 mg/kg；5.Ketamine 40 mg/kg.Compared with control，*.P<0.05；compared with CLP group,#.P<0.05.

2.5各組大鼠Bax、Bcl-2基因表達(dá) 由圖5可知，相比對照組，誘導(dǎo)模型組大鼠Bax蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比誘導(dǎo)模型組，氯胺酮組大鼠各組大鼠Bax蛋白及mRNA表達(dá)降低，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且變化呈濃度依賴性。

3 討論

膿毒癥可加重大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子主要包括促炎因子和抗炎因子，這兩種因子為拮抗作用。當(dāng)促炎因子水平升高，則體內(nèi)炎癥因子水平降低，表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)加?。豢寡滓蜃由?，體內(nèi)炎癥因子受到抑制，則炎癥反應(yīng)減弱[7]。目前研究較多的促炎細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[8]；抗炎細(xì)胞因子則包括IL-4、IL-10、IL-1等[9]。TNF-α可引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生代謝性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物增多，促使局部炎癥介質(zhì)大量合成[10]。TNF-α還可作用于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，使其廣泛釋放炎癥介質(zhì)從而減少心肌細(xì)胞供血，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧、蛋白聚糖合成能力下降及Ⅰ型和Ⅱ型膠原比例失調(diào)。同時IL-6也可促進(jìn)組織中MMPs、前列腺素等炎癥物質(zhì)產(chǎn)生和表達(dá)，加速炎癥反應(yīng)。IL-1α可增加MMP-3等基質(zhì)金屬蛋白酶降解酶在心肌細(xì)胞中的合成和分泌。本研究發(fā)現(xiàn)氯氨酮處理后大鼠外周血炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著降低、抗炎癥因子IL-10水平顯著升高，說明大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)顯著降低，提示氯氨酮可以通過降低炎癥反應(yīng)保護(hù)心肌細(xì)胞。隨著氯氨酮處理濃度增加，炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著降低、抗炎癥因子IL-10水平顯著升高，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。黃婷等[11]研究表明，降低炎癥反應(yīng)可保護(hù)心肌細(xì)胞，與本研究得出的結(jié)論一致。

目前常見的心肌損傷生物標(biāo)志物主要包括Mb、CK-MB和CK，三者在心肌細(xì)胞中含量豐富。周偉梁等[12]和Liebetrau等[13]的研究顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，上述蛋白會通過破裂的細(xì)胞迅速釋放到細(xì)胞，因此可以作為心肌損傷的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，氯氨酮處理后大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著降低，即大鼠心肌細(xì)胞受損程度顯著降低。隨著使用氯氨酮處理濃度增加，心肌損傷的生物標(biāo)志物Mb、CK、CK-MB水平逐漸降低，且呈氯氨酮劑量依賴性。沈定榮等[14]研究表明，降低Mb、CK、CK-MB使心肌細(xì)胞受損程度顯著降低，與本研究得出的結(jié)論一致。

膿毒癥除了使大鼠心肌細(xì)胞壞死外，還有另外一種細(xì)胞死亡形式，即細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種有序或程序性的細(xì)胞死亡方式，這種程序性死亡是受相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞主動性死亡過程[15，16]。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子[17]。賈曉鵬等[18]通過前列腺腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析得出，Caspase-9基因處于Caspase 家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子，通過自身的裂解使proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。這種有活性的Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因，主要作用機(jī)理是通過剪切另外的 Caspase 底物引起級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子較多，除Caspase家族外，Bcl-2 家族也是常見的凋亡控制基因。Bcl-2 家族主要由Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達(dá)量決定細(xì)胞是否凋亡[19-21]。Bax和Bcl-2表達(dá)呈相反趨勢，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下降時 Bax 表達(dá)上升，此時會促進(jìn)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低時，則會抑制細(xì)胞的凋亡。本研究表明，相比模型組，氯氨酮處理大鼠Bax、Caspase-3水平顯著降低、Bcl-2水平顯著升高，說明大鼠心肌細(xì)胞凋亡受到顯著抑制，且呈氯氨酮濃度依賴性。陳歡[22]研究表明，氯氨酮可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，與本研究的結(jié)論一致。

綜上所述，氯氨酮可通過調(diào)節(jié)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡因子水平和免疫功能保護(hù)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞，且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性，其作用機(jī)制可能與降低心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡因子和促炎因子水平、升高抗凋亡因子和抗炎因子水平有關(guān)。但本研究的心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)較少，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將使用流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)一步探討氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制。