杠板歸的創(chuàng)傷治愈作用與機制

杜金城，肖 浩，杜鋼軍

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，長沙 410208；2.河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封475004

創(chuàng)傷愈合是指在遭受外力作用下，機體組織損傷后涉及組織再生能力、肉芽組織增生和瘢痕形成的愈合修復(fù)過程[1]。中藥對創(chuàng)傷治愈有使用方便、不良反應(yīng)少、綜合療效好等獨特的優(yōu)勢[2]。杠板歸為蓼科蓼屬植物，一年生草本，又名刺犁頭、河白草、蛇不過等，廣泛分布于全國各地，資源豐富[3]。杠板歸味酸，入肺、小腸經(jīng) (南藥《中草藥學(xué)》)，有利水消腫、清熱活血、解毒散瘀之功效。主治水腫、丹毒、皰疹、瘰疬、黃疸、痢疾及毒蛇咬傷等癥[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，杠板歸擁有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、止血、降血壓等作用。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對杠板歸的創(chuàng)傷治愈成分及作用靶點進行預(yù)測，并對其進行創(chuàng)傷治愈作用的實驗驗證，為進一步研究其創(chuàng)傷治愈成分及機制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥品

杠板歸購自河南省開封市天濟大藥房，經(jīng)河南大學(xué)生藥教研室鑒定為杠板歸(Polygonum perfoliatumL.)的地上部分。其水煎液制備方法為:稱取干燥全草杠板歸40 g，加800 mL 蒸餾水浸泡1 h，煎煮30 min取水煎液。重復(fù)上述過程，共煎煮3次。將3次濾液加熱濃縮至1 mL相當(dāng)于0.2 g原藥材，凍存于-80℃冰箱，給藥前蒸餾水稀釋為小鼠體質(zhì)量的4 g/kg。

1.2 試劑

地塞米松(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號:H37021969)，二甲苯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號20170812)，冰醋酸 (淄博魯中化工輕工有限公司，批號20180315)，依文思藍(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站，批號E104208)。

1.3 實驗動物

雌性昆明小鼠，體質(zhì)量20～25 g，河南省實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(豫)2015-0002。

1.4 儀器

全波長酶標(biāo)儀，Spectra Max iD5，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.5 分析平臺與軟件

①TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(http://Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；②上海有機所中藥與有效成分數(shù)據(jù)庫(http://www.chemcpd.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp)；③PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；④Swiss TargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)；⑤STITCH(http://stitch.embl.de/)；⑥GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；⑦STRING 蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(https://string-db.org/)；⑧DAVID v6.8 人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)；⑨Omicshare 數(shù)據(jù)庫 (http://www.omicshare.com/)；⑩Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖形拓撲分析與編輯軟件。

2 方法

2.1 杠板歸對創(chuàng)傷愈合的影響[6]

30只小鼠隨機分為地塞米松組、杠板歸組和對照組每組10只，共3組。對照組給予0.5 mL純凈水1次/d；杠板歸組灌胃杠板歸水煎液2 g/kg，1次/d；地塞米松組口服地塞米松5 mg/kg，1次/d。給藥一周后，麻醉狀態(tài)下每只小鼠腳面剪取約2 mm×3 mm 大小傷口，繼續(xù)給藥1次/d，并用碘伏擦洗傷口防止感染，每3 d測量傷口大小1次，記錄傷口愈合程度。

2.2 杠板歸對疼痛的影響[7]

分組與給藥同2.1，第10 天各組給藥30 min后，用1 mL 注射器往小鼠腹腔注射體積分數(shù)為0.6%的醋酸0.2 mL/10 g，記錄醋酸注射10 min內(nèi)每只小鼠的扭體次數(shù)。

2.3 杠板歸對耳炎癥的影響[8]

分組與給藥同2.1，第7天給藥30 min后，各組小鼠右耳正反兩面滴二甲苯40μL，滴藥后30 min后處死小鼠，取9 mm 打孔器打下小鼠左右耳耳片，稱重，耳腫脹=右耳片重-左耳片重。

2.4 杠板歸對血管炎癥的影響[9]

分組與給藥同2.1，第7天給藥30 min后，各組小鼠腹部滴二甲苯100μL，滴二甲苯后立即尾靜脈注射伊文思藍，30 min后處死小鼠，剪取腹部染色皮膚，剪碎浸于5 mL丙酮生理鹽水(7∶3)中，每天上下顛倒3次，48 h后離心取上清液，酶標(biāo)儀630 nm測吸光度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用Graphpad prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，其中三組之間創(chuàng)傷愈合程度的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，疼痛、耳炎癥和血管炎癥的比較采取兩獨立樣本資料的t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 杠板歸有效成分篩選和成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

上海有機所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫檢索杠板歸有效成分，TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選有效成分，Pub Chem 數(shù)據(jù)庫下載有效成分SDF和SMILES格式，Swiss Target Prediction和STITCH 數(shù)據(jù)庫得到預(yù)測靶點，Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

2.7 炎癥、疼痛治療靶點篩選與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

以“inflammation”和“pain”為關(guān)鍵詞在Therapeutic Target Database(TTD)中收集與炎癥、疼痛相關(guān)的治療靶點，與杠板歸成分靶點進行對比，篩選出有關(guān)抗炎和鎮(zhèn)痛治療靶點。利用STRING 數(shù)據(jù)庫得到治療靶點蛋白相互作用關(guān)系圖，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值篩出核心靶點。

2.8 GO 注釋、KEGG 通路分析與成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

DAVID 數(shù)據(jù)庫對GO 注釋和KEGG 通路富集分析，Omicshare 對分析結(jié)果進行可視化，Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建杠板歸成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

3 結(jié)果

3.1 杠板歸的創(chuàng)傷愈合作用

本實驗采用小鼠皮膚創(chuàng)傷模型觀察杠板歸的創(chuàng)傷愈合作用，與模型組對比，杠板歸組創(chuàng)傷愈合較早(P＜0.05或P＜0.01)，見表1。

表1 杠板歸對小鼠創(chuàng)傷愈合的影響

3.2 杠板歸的鎮(zhèn)痛作用

本實驗采用醋酸扭體實驗觀察杠板歸的鎮(zhèn)痛作用，模型組小鼠扭體次數(shù)為42.1±8.7，杠板歸組小鼠扭體次數(shù)為24.7±8.4，兩組比較有非常顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 杠板歸對小鼠耳腫脹和腹膜炎的影響

3.3 杠板歸的抗炎作用

實驗采用小鼠耳腫脹與腹膜炎觀察杠板歸的抗炎作用，與模型組比較，杠板歸組小鼠耳腫脹和腹膜炎程度均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

3.4 杠板歸創(chuàng)傷治愈作用機制分析

根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到12種有效成分，分別為槲皮素(quercetin)、山柰酚/3，5，7，4'-四羥基黃酮(kaempferol)、白樺脂酸(Betulinic Acid)、3，3'-二-O-甲基并沒食子酸(3，3'-di-O-methylellagic acid)、白樺脂醇(betulinic acid)、熊果酸(ursolic acid)、蘆薈大黃素(aloeemodin)、大黃素甲醚(Physcion)、胡蘿卜苷(Daucosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮苷(quercitrin)、異鼠李素(isorhamnetin)、金絲桃苷(Hyperin)。這12 種有效活性成分可作用于232個靶點，其中19個是與杠板歸創(chuàng)傷治愈相關(guān)的治療靶點，見表3。PTGS2、STAT3、CASP3、MAPK8、BCL2、AKT1、TP53、EGFR 為核心靶點。GO 注釋分析與KEGG 通路分析顯示，杠板歸19個治療靶點參與79個KEGG 通路和299個生物過程(P＜0.05，count ＞7)，其中主要生物過程為 “細胞增殖”“細胞凋亡”“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”“炎癥反應(yīng)”等。主要KEGG 通路為“MAPK 信號通路”“JAK-STAT 信號通路” “HIF-1信號通路”“PI3KAkt信號通路”“神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路”等。

表3 杠板歸炎癥治療靶點

4 討論

目前，從杠板歸中已分離鑒定出130余種化學(xué)成分，其中主要化學(xué)成分是黃酮類物質(zhì)，此外還有醌類、苯丙素類、萜類、生物堿類及其他衍生物等[10]。本文實驗結(jié)果顯示，杠板歸有確切的促進創(chuàng)傷愈合作用，可以降低炎癥反應(yīng)和產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，與糖皮質(zhì)激素地塞米松抗炎同時延緩創(chuàng)傷愈合明顯不同，對創(chuàng)傷愈合有綜合治療作用。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩出杠板歸12種主要成分作用于232個靶點，其中19個基因與炎癥、疼痛和損傷修復(fù)相關(guān)，EGFR、STAT3、MAPK8、BCL2、TP53、AKT1、CASP3、PTGS2為8個核心靶點，能干預(yù)“MAPK 信號通路”“JAK-STAT 信號通路” “HIF-1信號通路”“PI3K-Akt信號通路”“神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路”等產(chǎn)生抗炎、鎮(zhèn)痛及治愈創(chuàng)傷作用。JAK-STAT 信號通路是與炎癥密切相關(guān)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與免疫調(diào)節(jié)以及細胞的增殖、分化、凋亡等許多重要的生物學(xué)過程[11-12]。在JAK1/STAT3信號途徑中，STAT3蛋白是轉(zhuǎn)錄活化因子家族和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要成員[13]。STAT3 可在IL-12和IL-23作用下促進炎癥因子的表達[14]。因此，杠板歸抗炎、鎮(zhèn)痛、促進創(chuàng)傷愈合的主要機制可能與12個活性成分作用于上述信號通路中多個重要靶點有關(guān)。

綜上所述，杠板歸促進創(chuàng)傷愈合作用與其12個活性成分阻止“PI3K-AKT 信號通路”“Jak-STAT信號傳導(dǎo)”“MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”等以此減輕小鼠炎癥和疼痛、促進蛋白質(zhì)合成有關(guān)，為進一步深入研究杠板歸在創(chuàng)傷治療方面的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。