HPV 分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

彭小媚，陳棟，林永恩，陳善昌

(廣西賀州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 賀州）

1 前言

宮頸癌仍然是全世界女性中第三大最常見的癌癥，每年約有529，800 例新病例和275，100 例死亡[1,2]。值得注意的是，宮頸癌的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家和欠發(fā)達(dá)國(guó)家之間是不成比例分布的[3]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，因?yàn)橛邪┌Y篩查和政府巨額預(yù)算資助的HPV 疫苗接種[4]，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已逐漸下降[5]，而在欠發(fā)達(dá)國(guó)家中[6,7]，宮頸癌是仍然是女性中最普遍的癌癥之一，也是癌癥死亡的主要原因。例如，在中國(guó)，觀察到宮頸癌的發(fā)病率和死亡率趨勢(shì)顯著增加，尤其是在年輕女性中[7]。宮頸癌已成為15 至44歲的中國(guó)女性中第二常見的女性癌癥和第三大癌癥死亡原因[8]。在印度，子宮頸癌是女性癌癥的第二大誘因。估計(jì)每年全世界子宮頸癌死亡人數(shù)的四分之一（約77，100 萬）發(fā)生在世界第二人口稠密的國(guó)家[8,9]。

人類乳頭瘤病毒（HPV）感染是全世界最常見的性傳播感染，持續(xù)性宮頸感染是宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)因素。此外，宮頸粘膜上皮細(xì)胞中HPV 感染的持續(xù)存在，癌前病變（宮頸上皮內(nèi)瘤變3 即CIN3）與宮頸癌之間存在明確的病因?qū)W聯(lián)系。如今，已經(jīng)定義了200 多種HPV 基因型，其中50 種可以感染宮頸上皮細(xì)胞。但是，只 有16 種HPV 類 型（16、18、31、33、34、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70）被歸類為高風(fēng)險(xiǎn)（hrHPV），而14 種（排除34 和59）顯示出與宮頸癌有因果關(guān)系的強(qiáng)有力證據(jù)?；趆rHPV 與宮頸癌之間明確的因果關(guān)系，美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)學(xué)會(huì)指南建議在篩查人群中進(jìn)行HPV DNA 檢測(cè)而不是細(xì)胞學(xué)檢查。與基于細(xì)胞學(xué)的篩選方法相比，HPV 分子生物學(xué)檢測(cè)不依賴于形態(tài)學(xué)解釋，而是基于HPV DNA，HPV mRNA 或其他病毒標(biāo)記的檢測(cè)。在過去的二十年中，HPV 檢測(cè)已成為許多國(guó)家宮頸癌篩查，分類和治療后隨訪臨床指南的重要組成部分，本文就國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的HPV 分子生物學(xué)檢測(cè)方法及其應(yīng)用進(jìn)展作一簡(jiǎn)述。

2 目前用于宮頸篩查的HPV 檢測(cè)方法

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱PCR 技術(shù)，是一種利用DNA 變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA 片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列。僅需用極少量模板，在一對(duì)引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增至100 萬-200 萬份拷貝。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA 聚合酶的酶促合成反應(yīng)。一般認(rèn)為，PCR 技術(shù)有高敏感度、高特異性的特點(diǎn)，簡(jiǎn)便快速，臨床應(yīng)用廣泛[10]。

2.2 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)

這種技術(shù)是把寡核苷酸探針固定在固相尼龍 膜上，標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA 提取，PCR 擴(kuò)增后雜交，顯色及結(jié)果判讀。PCR 反向斑點(diǎn)印跡HPV 基因分型作為在醫(yī)院為基礎(chǔ)的人群中子宮頸癌的主要篩查測(cè)試，是一種成本較低且有效的宮頸癌初篩，用于基于醫(yī)院的機(jī)會(huì)性篩查。目前用于23 種類型的PCR 反向斑點(diǎn)印跡 HPV基因分型試劑盒（深圳亞能有限公司）可以檢測(cè)出18 種HR-HPV類型，包括HPV-16，-18，-31，-33，-35，-39，-45， -51，-52，-53，-56，-58，-59，-66，-68，-73，-82 和-83，以及5 種LR-HPV類型，包括HPV-6，-11，-42，-43 和-81。此方法已獲得中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的許可。所有檢測(cè)程序均按照試劑盒提供的制造商說明進(jìn)行[11]，其特異度、敏感度分別為95.36%和96.36%，PCR 反向斑點(diǎn)印跡HPV 基因分型測(cè)試可以為HPV 檢測(cè)提供可靠且敏感的臨床參考[12]。長(zhǎng)期的觀察研究表明，HPV-16 和HPV-18 與高度宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)[13]。與基于PCR 的方法相比，PCR 反向斑點(diǎn)印跡HPV 基因分型測(cè)試作為一種主要篩查方法，在檢測(cè)CIN2+/CIN3+方面具有更高的靈敏度和特異性，且誤診率最低。

2.3 第2 代雜交捕獲法(HC2)

Hybrid Capture 2（HC2）HPV DNA 測(cè)試已被廣泛用于確定HPV 感染以及檢測(cè)HSIL 和宮頸癌。通常，CIN2 檢測(cè)的靈敏度為84.9%至100%，特異性為69.5%至95.8%[14]。HC2 技術(shù)利用特異性識(shí)別HPV DNA 序列的RNA 探針對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行捕獲，然后通過標(biāo)記的抗體識(shí)別雜交鏈，放大雜交鏈光信號(hào)，通過測(cè)定光信號(hào)對(duì)13 種高危型HPV 進(jìn)行半定量檢測(cè)[15]。1999 年，HC2 測(cè)試被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)為檢測(cè)13 種hrHPV 基因型的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，該測(cè)試具有一些缺點(diǎn)，包括無法將HPV16 或HPV18與其他hrHPV 區(qū)別開來，并且沒有內(nèi)部控制。此外，HC2 測(cè)試與探針混合物與非靶向HPV 類型的有一定的交叉反應(yīng)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

這項(xiàng)新技術(shù)是在80 年代中期對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的改進(jìn)。通過PCR，基本上可以以循環(huán)過程擴(kuò)增復(fù)雜樣品中存在的任何核酸序列，以產(chǎn)生大量易于分析的相同拷貝。但是，作為一種分析技術(shù)，原始的PCR 方法存在一些嚴(yán)重的局限性。通過首先擴(kuò)增DNA序列，然后分析產(chǎn)物，定量非常困難，因?yàn)镻CR 產(chǎn)生了基本上相同量的產(chǎn)物，而與最初存在的DNA 模板分子的量無關(guān)。這種限制在1992 年由Higuchi 等人開發(fā)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 解決了。在實(shí)時(shí)PCR 中，通過監(jiān)測(cè)與反應(yīng)產(chǎn)物成正比的染料或探針的熒光，以及與獲得產(chǎn)物所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)成正比，來監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中形成的產(chǎn)物量。特定數(shù)量的DNA 分子被記錄下來。假設(shè)一定的擴(kuò)增效率，通常接近每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的分子數(shù)量的兩倍，則可以計(jì)算最初存在于樣品中的擴(kuò)增序列的DNA 分子的數(shù)量。借助當(dāng)今可用的高效檢測(cè)化學(xué)方法，靈敏儀器和優(yōu)化測(cè)定方法，可以以前所未有的準(zhǔn)確度和靈敏度檢測(cè)復(fù)雜樣品中特定序列的DNA 分子的數(shù)量，足以檢測(cè)單個(gè)分子。這類方法不但能檢出具體的HPV 亞型，而且可以對(duì)病毒負(fù)載量進(jìn)行檢測(cè)，有些目前已被FDA 批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用。這類方法檢測(cè)敏感，成本低，用時(shí)也比較短，僅需約2.5h[16]。例如Cobas 4800 HPV 就是采用實(shí)時(shí)定量熒光技術(shù)。Cobas 4800 HPV Test[17]是2011 年被美國(guó)FDA 唯一批準(zhǔn)可同時(shí)檢測(cè)12 種高危HPV 及16 和18 型HPV 的試劑盒。該方法使用的是光譜獨(dú)特的熒光染料標(biāo)記TaqMan 探針，將25 微升樣品添加到96 孔PCR板的25 mL 預(yù)混液中，之后轉(zhuǎn)移至cobas 4800 系統(tǒng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)模塊進(jìn)行檢測(cè)。臨床研究表明，Cobas 試驗(yàn)的敏感性與與HC2 檢測(cè)有很高的一致性（91.4%～98.0%）[18]，但是Cobas 試驗(yàn)具有更高的特異性，它與其他低風(fēng)險(xiǎn)HPV 型的交叉反應(yīng)水平較低。Lapierre 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Cobas 4800 HPV 檢測(cè)的重復(fù)性和特異性較好，已被越來越多的臨床機(jī)構(gòu)認(rèn)可和購買使用。

2.5 下一代測(cè)序技術(shù)(next - generation sequencing， NGS)

目前，HPV 檢測(cè)方法主要使用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，信號(hào)擴(kuò)增測(cè)定法（HC2），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法（COBAS 4800 實(shí)時(shí)測(cè)試）等。這些檢測(cè)方法有一定的局限性，而下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)克服了這些方法的局限性，NGS 不僅可以檢測(cè)負(fù)荷量、病毒亞型，還可以檢測(cè)細(xì)胞染色體DNA 水平的損害，例如HPV DNA 的插入位點(diǎn)及整合等，有各種各樣的基因整合發(fā)現(xiàn)工具可以檢測(cè)人類基因組中不同的病原體插入。這些工具有其特定的第三方需求，他們可以檢測(cè)HPV 序列以及其他病毒的存在，缺點(diǎn)是檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜，檢測(cè)試劑成本比較昂貴，對(duì)操作人員的整體知識(shí)水平要求也比較高[20,21]。更重要的是，它們本身并不是特定于HPV 檢測(cè)的。近年來，由Helicos Biosciences 公司開發(fā)的NGS，和其他平臺(tái)相比，已經(jīng)大大降低了費(fèi)用，并且檢測(cè)效率有了很大的提高，目前已經(jīng)得到了很多臨床機(jī)構(gòu)的認(rèn)可[22-24]。

3 小結(jié)

目前已證實(shí)，宮頸 癌的主要致病原因是高危型 的HPV 感染，而持續(xù)性的高危感染更易引發(fā)宮頸癌，對(duì)于持續(xù)的HPV 感染，發(fā)展為子宮頸癌需要數(shù)十年的時(shí)間。因此，這個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間窗口為臨床干預(yù)提供了千載難逢的機(jī)會(huì)。對(duì)其感染進(jìn)行 早期和正確的診斷，無疑對(duì)于宮頸癌及其他 HPV 相 關(guān)惡性腫瘤的預(yù)防及診治有重要的臨床意義和社會(huì) 價(jià)值[25]。目前市場(chǎng)上的絕大多數(shù)HPV檢測(cè)都具有很高的分析靈敏度，它們可能會(huì)產(chǎn)生大量臨床上無關(guān)緊要的陽性結(jié)果，截至2018 年7 月，只有14 種商業(yè)HPV 檢測(cè)（在全球市場(chǎng)上HPV 檢測(cè)中）可被認(rèn)為已完全或部分通過了基于HPV 的子宮頸癌初步篩查[26]。臨床對(duì) HPV 檢測(cè)方法要求靈敏度高，特異性好，結(jié)果準(zhǔn)確、無交叉污染、檢測(cè)時(shí)間短而快速、成本低、操作簡(jiǎn)單、且易于自動(dòng)化?，F(xiàn)有 HPV 檢測(cè)方法尚不能滿足以上所有要求。但隨著分子生物學(xué) 檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，相信不久的將來就會(huì)有滿足以上所有需求的HPV 檢測(cè)方法出現(xiàn)，更好的服務(wù)于臨床及實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)。