二代測序技術(shù)在骨髓增生異常綜合征基因突變檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

王笑然，周虎，丁冰潔，劉建平，徐佩佩

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州）

0 引言

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一種以造血細(xì)胞異常增生、外周血細(xì)胞減少和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)易感性為特征的克隆性血液學(xué)疾病。細(xì)胞遺傳學(xué)歷來在MDS 的診斷和預(yù)后中發(fā)揮重要作用，已有多個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)與MDS 的疾病類型相關(guān)，而對這些基因突變的了解為定義的MDS 亞型提供了思路，同時(shí)也有助于開發(fā)治療MDS 的新療法。二代測序技術(shù)在MDS 診斷、預(yù)后和監(jiān)測中的確切作用尚不清楚，本文將就二代測序技術(shù)在MDS 基因突變檢測中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1 二代測序在MDS 診斷和分型中的應(yīng)用

在2016 年修訂的2008 年WHO 指南中，對MDS 亞型進(jìn)行了重新定義，強(qiáng)調(diào)了分化異常的細(xì)胞程度和百分比的地位。染色體核型信息的加入能使反應(yīng)性細(xì)胞減少或細(xì)胞異常與真正的MDS 更容易區(qū)分。當(dāng)患者出現(xiàn)原因不明的細(xì)胞減少癥和MDS 臨床表現(xiàn)一致，但不完全符合細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，某些細(xì)胞遺傳學(xué)異常，如del(7q)、t(2;11)(p21;q23)可作為確診的依據(jù)。然而，并不是所有的MDS 病例都有可識別的核型異常。高達(dá)80%的復(fù)發(fā)MDS 患者都存在異常染色體核型，但不到50%的初診MDS 患者可檢測到核型異常。通過二代測序檢測基因突變有助于進(jìn)一步區(qū)分MDS 亞型。伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多的MDS 患者中，70%-80% 的病例中存在SF3B1 突變，盡管MDS 伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多(MDSwithringsideroblasts, MDS-RS) 的診斷依據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)中被要求為至少達(dá)到15%的環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞，但在SF3B1突變的情況下，僅需要5% 的環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞即可做出診斷。SF3B1 突變患者的臨床和形態(tài)學(xué)特征可能不同, 但SF3B1 與較低的骨髓細(xì)胞百分比、較高的中位血小板計(jì)數(shù)、較高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和較高的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)之間存在相關(guān)性[1]。SF3B1 基因突變成為MDS 亞型的診斷依據(jù)，正是基因突變在MDS 診斷和分型中的重要臨床價(jià)值的體現(xiàn),其他基因的突變狀態(tài)對MDS 的鑒別診斷也有一定的價(jià)值,目前在指南中作為推薦選做檢測項(xiàng)目, 包括TP53、TET2、DNMT3A、IDH1/2、EZH2、ASXLl、SRSF2、RUNXl、U2AFl、SETBPl 等。二代測序技術(shù)的應(yīng)用，會使越來越多的基因突變在MDS 的診斷和分型中發(fā)揮重要作用。

2 二代測序在MDS 危險(xiǎn)度分層中的應(yīng)用

IPSS 和IPSS-R 是目前最廣泛使用的MDS 預(yù)后評分系統(tǒng)，但也有部分患者的預(yù)后與他們的風(fēng)險(xiǎn)評分不一致。其中一些差異可以用基因突變來解釋。例如，低風(fēng)險(xiǎn)的del(5q) MDS 患者傾向于對利那度胺有良好的反應(yīng)，向AML 進(jìn)展的更少，但高達(dá)20%的del(5q)患者在診斷時(shí)被發(fā)現(xiàn)存在TP53基因突變。一項(xiàng)針對944 名MDS 患者的大型研究發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)具有預(yù)后意義的基因[2]。在這組基因中，TP53、ETV6、RUNX1、EZH 和ASXL1 的突變已被證實(shí)為不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。其他研究還發(fā)現(xiàn)，SRSF2 還可作為不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[3]。值得注意的是，將這些基因與傳統(tǒng)的IPSS-R模型相結(jié)合，能夠比僅基于IPSS-R 或僅基于突變的模型更準(zhǔn)確地預(yù)測患者生存期[2]。當(dāng)骨髓原始細(xì)胞低于5% 時(shí)，SRSF2、U2AF1 和ASXL1 突變與較短的生存期相關(guān)，但在較高的原始細(xì)胞負(fù)荷下卻無有價(jià)值的相關(guān)性[4]。將預(yù)后模型擴(kuò)展到接受過多種治療的患者和繼發(fā)性MDS 患者也是一個(gè)重點(diǎn)。在建立了年齡、IPSS-R 評分、EZH2、SF3B1 和TP53突變與生存期的獨(dú)立相關(guān)性后，比單獨(dú)使用IPSS-R 更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的生存期。重要的是，該模型評估了初治和復(fù)發(fā)MDS 患者，并在接受多種治療的患者中得到了驗(yàn)證。另一項(xiàng)針對亞洲原發(fā)性MDS 患者的研究，將5 個(gè)與較短生存期相關(guān)的獨(dú)立基因(DNMT3A、TP53、ASXL1、IDH2 和CBL)的突變狀態(tài)納入一個(gè)新的模型。在WHO2016 年分類組和IPSS-R類別中，具有這些突變的患者的生存期較短，與處于下一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)類別的患者具有明顯差異[5]。隨著越來越多的研究探索突變狀態(tài)在預(yù)后評分中的作用，如何調(diào)整IPSS-R 以納入基因信息和復(fù)合突變MDS 的生物學(xué)復(fù)雜性將變得更加清晰。

3 二代測序在MDS 治療中的應(yīng)用

雖然許多新的治療方法正在研發(fā)中，但只有三種藥物——來那度胺、阿扎胞苷和地西他濱被食品和藥物管理局(FDA) 批準(zhǔn)用于治療MDS，而且自2006 年以來沒有新的藥物被批準(zhǔn)。無臨床表現(xiàn)及IPSS-R 評分較低的患者常常被忽略，直到他們因血細(xì)胞減少而出現(xiàn)癥狀或疾病發(fā)生進(jìn)展才被診斷。低風(fēng)險(xiǎn)性貧血常通過輸血和促紅細(xì)胞生成素(erythropoiesis-stimulating agents，ESAs)來治療。疾病進(jìn)展、伴del(5q)且對來那度胺耐受的患者，可以使用去甲基化藥物(DNMTIs)，如阿扎胞苷或地西他濱進(jìn)行治療。異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT）是唯一可治愈MDS 的方法，但大多數(shù)患者不符合移植條件[6]。

來那度胺可用于治療伴del(5q) 的MDS 患者，當(dāng)伴有TP53 基因突變時(shí)可能預(yù)示著來那度胺治療失敗或進(jìn)展為AML。將二代測序用于指導(dǎo)ESAs 的使用尚未得到充分的研究。在一項(xiàng)對79 例接受ESA 治療的低危MDS 患者研究中發(fā)現(xiàn)，最常見的基因突變是SF3B1、TET2、ASXL1 和DNMT3A，進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，超過兩種突變與紅細(xì)胞反應(yīng)性降低顯著相關(guān)，然而在多因素分析中則發(fā)現(xiàn)，突變的數(shù)量或類型與紅細(xì)胞反應(yīng)性降低之間沒有明顯的相關(guān)性[7]。將二代測序用于指導(dǎo)去甲基化藥物應(yīng)用值得探究。阿扎胞苷是首個(gè)通過隨機(jī)試驗(yàn)明確對MDS 有效的藥物，但是只有一半的患者對該藥有反應(yīng)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)TET2 突變可以提高藥物反應(yīng)率，而DNMT3A 突變與藥物不良應(yīng)答之間存在相關(guān)性，但是沒有進(jìn)一步的研究來支持這些結(jié)論[9]。然而，體細(xì)胞基因突變可以預(yù)測治療反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，DNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的突變和3 個(gè)或3 個(gè)以上突變的存在與去甲基化藥物反應(yīng)時(shí)間的縮短有關(guān)。一項(xiàng)回顧性研究表明，TP53 突變患者對去甲基化藥物的應(yīng)答時(shí)間明顯較短，大約為6 個(gè)月，但是該研究沒有發(fā)現(xiàn)基于TP53 突變狀態(tài)的總體應(yīng)答率的差異[10]。相反,Welch 等[11]發(fā)現(xiàn)，在接受地西他濱治療的MDS/AML 患者中，TP53 突變的患者能夠更快的清楚骨髓異常原始細(xì)胞并且具有比預(yù)期更長的生存率, 但是這些結(jié)果只在21 例完全緩解率為19% 的TP53 突變患者中發(fā)現(xiàn)。其他關(guān)于TP53 突變患者對去甲基化藥物反應(yīng)的研究并沒有一致證明地西他濱優(yōu)于阿扎胞苷。因此，還需要進(jìn)一步研究來明確TP53 突變對去甲基化藥物治療反應(yīng)的影響。

基因突變狀態(tài)，尤其是TP53 的突變狀態(tài)，可能有助于預(yù)測Allo-HSCT 患者的預(yù)后[12]。雖然TP53、TET2、DNMT3A、RUNX1 和ASXL1 的突變被認(rèn)為是Allo-HSCT 后生存期縮短的指標(biāo)，但TP53 是唯一一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測因子，可以預(yù)測各組間的生存期縮短。而在MDS/MPN 中，RAS 途徑突變可以預(yù)測到較短的生存期，RAS 途徑突變和TP53 突變均與Allo-HSCT 后復(fù)發(fā)時(shí)間較短有關(guān)。根據(jù)對797 例MDS 移植患者的研究發(fā)現(xiàn)，移植患者TP53 突變的不良預(yù)后可能與復(fù)雜核型有關(guān)，與復(fù)雜核型患者相比，無復(fù)雜核型的TP53 突變患者移植后生存期顯著延長。但是目前仍不清楚這是否與患者的非復(fù)發(fā)死亡率相關(guān)。二代測序可能有助于監(jiān)測疾病殘余和預(yù)測移植后的復(fù)發(fā)。與其他研究一樣，RAS 途徑、RUNX1和ASXL1 的突變與Allo-HSCT 后的死亡風(fēng)險(xiǎn)沒有顯著相關(guān)性。此外，這些基因的突變與移植后疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)之間沒有顯著的聯(lián)系。持續(xù)存在的突變可能與移植效果差有關(guān)的觀點(diǎn)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 存在的問題及未來展望

在MDS 中通常發(fā)生突變的基因并不是MDS 特有的。例如，TET2 和DNMT3A 的體細(xì)胞突變可以在所有的髓系腫瘤和淋系疾病中看到，SF3B1 的突變也可以在骨髓增殖性腫瘤（MPN）和慢性淋巴細(xì)胞白血病中看到。此外，在健康人群中也可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突變。研究報(bào)告顯示，高達(dá)79%的MDS 患者在NGS 靶板上發(fā)現(xiàn)突變,二代測序具有巨大的潛力，可以幫助臨床醫(yī)生在觀察突變頻率、治療藥物的選擇、其他合并癥的評估以及評估預(yù)后的能力等方面做出決策。隨著二代測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，MDS 基因突變的種類被發(fā)現(xiàn)的越來越多，對預(yù)后和疾病的分類有著巨大的貢獻(xiàn)。對這些突變的了解為靶向治療的研發(fā)提供了依據(jù)和思路，利用二代測序來檢測變異頻率低的等位基因突變，可以針對這些遺傳缺陷來進(jìn)行治療。然后，對二代測序結(jié)果的解讀也是一個(gè)挑戰(zhàn)，不同的突變基因有著不同的突變位點(diǎn)和類型，這些在疾病的診斷和治療中是否有一定影響尚待進(jìn)一步明確。標(biāo)準(zhǔn)化二代測序方法和變量調(diào)節(jié)，以提高數(shù)據(jù)的完整性也是二代測序在MDS檢測中的重要挑戰(zhàn)。