金黃色葡萄球菌脫水鯊烯脫氫酶(CrtN)和DNA結(jié)合蛋白Sso7d的融合表達

趙元蕾 ，鄭迎迎，郭瑞庭，賈士儒，劉衛(wèi)東

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

感染性疾病是引起人類死亡的第二主要原因[1]，而金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)則是引起人類感染的主要病原體之一[2]．它可以引起局部化膿感染，也可以引發(fā)壞死性肺炎、心內(nèi)膜炎和骨髓炎等感染性疾病[3]．抗生素是 20世紀醫(yī)學(xué)史上最偉大的發(fā)現(xiàn)，對于人類平均壽命的延長起了關(guān)鍵的作用[4]，讓醫(yī)生們在對抗金黃色葡萄球菌感染時有了更好的治療方案．但由于抗生素的大量使用，使得金黃色葡萄球菌對其產(chǎn)生了抗性，進化出了各種耐藥性變異體，最知名的當屬“超級細菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)[5]．歐盟食品管理局(EFSA)以及歐盟疾控中心(ECDC)在 2013年發(fā)布的研究報告稱，在住院病人感染中，51%,的導(dǎo)管相關(guān)血流感染、52%,的尿路導(dǎo)管相關(guān)感染、42%,的呼吸性性肺炎以及 43%,的外科手術(shù)部位感染均與金黃色葡萄球菌相關(guān)[6]．金黃色葡萄球菌引起的感染也被認為是許多家禽以及寵物的病原來源[7]，因此深入了解金黃色葡萄球菌在宿主體內(nèi)表達調(diào)控的生理過程，尋找對抗金黃色葡萄球菌的一些新的思路顯得尤為重要[8]．有研究[9–10]表明，當金黃色葡萄球菌出現(xiàn)缺少色素或色素減少的突變種時，其抵抗脂肪酸侵害的能力就迅速減弱，有可能被宿主直接殺死．因此，阻礙金黃色葡萄球菌中色素的生物合成可以作為對抗其感染的一種新的策略[11]．

金黃色葡萄球菌的色素STX是由一系列酶催化生成[12]．2008年，Eric Oldfield團隊解析出了色素合成起始酶 CrtM 的蛋白結(jié)構(gòu)，借此合理設(shè)計出 CrtM高效抑制劑，為篩選抵抗金黃色葡萄球菌的新藥物提供了思路[13]．而CrtN也是金黃色葡萄球菌色素STX合成過程中的關(guān)鍵酶．它能夠催化脫水鯊烯(dehydrosqualene)經(jīng)三步連續(xù)脫氫反應(yīng)生成色素 STX的中間產(chǎn)物 4，4’-四神經(jīng)孢子(4，4’-diaponeurosporene)[14]．抑制 CrtN 的功能可以降低金黃色葡萄球菌的致病性．2016年，上海藥物所的藍樂夫研究員篩選了 CrtN的 400多種抑制劑，發(fā)現(xiàn)萘替芬(naftifine hydrochloride)是可以對3種MRSA起到抑制作用的最有效的抑制劑[15]．但在沒有解析得到CrtN蛋白結(jié)構(gòu)、對其具體催化機制不清楚的前提下，尋找設(shè)計酶的抑制劑有著非常大的局限性且工作量巨大．通過解析 CrtN蛋白結(jié)構(gòu)，可以更準確地了解酶的作用機理及作用位點，省時省力地找到高效且毒性小的抑制劑．

Sso7d蛋白是來自極端嗜熱古生菌硫磺礦硫化葉菌的小分子 DNA結(jié)合蛋白[16]，相對分子質(zhì)量為7.3×103．有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) Sso7d的蛋白晶體的每個晶格中都只有一個蛋白質(zhì)分子[17]，而且本實驗室已有先例證明，其可以有效地幫助蛋白正確折疊，有利于晶體內(nèi)部蛋白分子之間有序堆疊，促進高分辨蛋白晶體的形成[18]．

本課題組曾嘗試在大腸桿菌中對 CrtN進行表達，但發(fā)現(xiàn)目的蛋白絕大部分以包涵體形式存在，無法得到可溶 CrtN蛋白．本研究中引入 DNA結(jié)合蛋白 Sso7d，將其與 CrtN 在大腸桿菌中的表達進行融合表達嘗試，以期獲得純度較高的目標蛋白，為后續(xù)進行蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析工作，以及進一步揭示其催化機理并合理設(shè)計 CrtN靶點抑制劑，篩選新型金黃色葡萄球菌抗生素奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株

pET3b-Sso7d質(zhì)粒為本實驗室保存，pET-46 Ek/LIC載體購自 Invitrogen公司，大腸桿菌(E．coli)DH5α感受態(tài)、E．coli BL21(DE3)感受態(tài)均購自北京康為世紀生物科技有限公司．

1.1.2 試劑與儀器

氨芐青霉素，BBI公司；IPTG，Solarbio公司，蛋白 marker、MES SDS Runing Buffer、SDS-PAGE 電泳膠，Invitrogen 公司；pET-46 Ek/LIC Cloning Kits，Novagen公司；DNA marker，上海捷瑞生物工程有限公司；Ex Taq聚合酶、dNTPs及 PCR反應(yīng)緩沖液，TaKaRa公司；蛋白染液考馬斯亮藍 G250，北京康為世紀生物科技有限公司；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，Biomed 公司；一抗(鼠源抗 His-tag)，ABCAM 公司；二抗(HRP山羊抗小鼠)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司．

PCR儀、高速冷凍離心機，德國 Eppendorf公司；核酸電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad公司；恒溫搖床，江蘇太倉試驗設(shè)備廠；低溫高壓細胞破碎機，廣州聚能生物科技有限公司；?KTA純化系統(tǒng)，美國 GE公司；蛋白質(zhì)電泳儀，Invitrogen公司；硝酸纖維素膜、超濾管，美國Merck Millipore公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)發(fā)表在NCBI的金黃色葡萄球菌CrtN基因序列及商品化載體pET-46 Ek/LIC的信息設(shè)計上、下游特異性引物pET-46 Ek/LIC-CrtN-sense：5'-GACGA CGACAAGCATCACCACCACCATCAC ATGAA GATTGCAGTAATTGGTGCAGGTGTC-3'(下劃線為6 個 His標簽)、pET-46 Ek/LIC-CrtN-antisense：5'-G AGGAGAAGCCCGGTTATACGCCCCGCTCAATA TCTTTAATC-3'．上游引物加入了6個His組氨酸標簽. 根據(jù)發(fā)表在NCBI的金黃色葡萄球菌CrtN基因序列、小分子DNA結(jié)合蛋白Sso7d基因序列及商品化載體pET-46 Ek/LIC的信息設(shè)計上、下游特異性引物，CrtN基因與 Sso7d基因之間添加 5個氨基酸(AGAGA)作為Linker．根據(jù)Sso7d連接在CrtN的N端和 C端兩種情況，分別設(shè)計引物見表 1．以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成．

表1 Overlapping PCR所用引物Tab. 1 Primers for overlapping PCR

1.2.2 基因的PCR擴增

(1)以全基因合成的CrtN序列(由上海生工生物工程有限公司合成)為模板擴增 CrtN基因．PCR反應(yīng)體系為 100,μL：Ex Taq 酶 1,μL，10×Buffer 10,μL，2.5,mmol/L的dNTPs 5,μL，10,mmol/L pET-46,Ek/LICCrtN-sense 2,μL ，10,mmol/L pET-46,Ek/LIC-CrtN-antisense 2,μL，150,ng/μL CrtN 基因模板 3,μL，無菌水 77,μL．PCR 參數(shù)設(shè)置：95,℃預(yù)變性 3,min；95,℃加熱變性 30,s，60,℃退火 30,s，72,℃延伸 2,min，循環(huán) 30次；72,℃總延伸 7,min．電泳后的 PCR產(chǎn)物用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化回收.

(2)以Sso7d連接在CrtN的N端為例. overlapping PCR共分為3個關(guān)鍵的步驟：

第一步，用合成的引物，以全基因合成 CrtN序列和 pET3b-Sso7d質(zhì)粒為模板分別擴增 CrtN和Sso7d．其中擴增 CrtN 基因的引物為 CrtN-sense與46-CrtN-antisense，擴增 Sso7d基因的引物為 46-Sso7d-sense與Sso7d-antisense．PCR反應(yīng)體系及參數(shù)設(shè)置與(1)相同，電泳后的 PCR產(chǎn)物用 PCR 產(chǎn)物回收試劑盒分別純化回收．

第二步，將回收后的兩個目的片段 Sso7d與CrtN作為正反向引物進行PCR，此次沒有模板．PCR反應(yīng)體系為 25,μL：Ex Taq 酶 0.5,μL，10×Buffer 5,μL，2.5,mmol/L dNTPs 2.5,μL，62,ng/μL 的回收片段 Sso7d 5,μL，55,ng/μL 的回收片段 CrtN 5,μL，無菌水 7,μL．PCR 參數(shù)設(shè)置：95,℃預(yù)變性 5,min；95,℃加熱變性 30,s，58,℃退火 10,min，72,℃延伸 5,min，循環(huán)10次；72,℃總延伸10,min．

第三步，取上一步 PCR的產(chǎn)物作為模板擴增Sso7d-CrtN 目的基因．PCR 反應(yīng)體系為 100,μL：Ex Taq 酶 1,μL，10×Buffer 10,μL，上一步 PCR 產(chǎn)物7,μL，10,mmol/L 的 46-Sso7d-sense 1,μL，10,mmol/L 46-CrtN-antisense 1,μL，2.5,mmol/L dNTPs 10,μL，PCR stimulant 20,μL，無菌水 77,μL．PCR 參數(shù)設(shè)置：95,℃預(yù)變性 3,min；95,℃加熱變性 30,s，65,℃退火30,s，72,℃延伸 2,min，循環(huán) 30次；72,℃總延伸7,min．電泳后的 PCR產(chǎn)物用 PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化回收．

Sso7d連接在CrtN的C端PCR過程與上述過程基本相同．其中，第一步擴增 Sso7d基因的引物為Sso7d-sense與46-Sso7d-antisense，擴增CrtN基因的引物為 46-CrtN-sense與 CrtN-antisense；第三步擴增CrtN-Sso7d目的基因時，加入的正反向引物分別為46-CrtN-sense和 46-Sso7d-antisense．

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用pET-46,Ek/LIC Cloning Kits將純化回收到的目的片段連接在pET-46 Ek/LIC載體上．反應(yīng)體系為 20,μL：T4 DNA 聚合酶 0.4,μL，25,mmol/L dATP 2,μL，100,mmol/L DTT 1,μL，10× T4,DNA 連接酶Buffer 2,μL，純化 DNA 片段 14.6,μL．將上述體系輕輕混勻，置于 22,℃金屬浴上 30,min，然后轉(zhuǎn)至 75,℃金屬浴上 20,min．取體系溶液 10,μL加入 1,μL pET-46,Ek/LIC 載體，混勻后置于 22,℃金屬浴上 1,h，再加入 25,mmol/L EDTA 1,μL，置于 22,℃金屬浴上5,min，至此連接完成．將連接產(chǎn)物采用 42,℃熱激法轉(zhuǎn)化到 E．coli感受態(tài)細胞 DH5α，涂布于含有100,mg/L氨芐青霉素抗性的 LB平板上，37,℃倒置培養(yǎng)12～16,h．挑取平板上單個圓潤菌落到5,mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，待菌液 A600＝0.6～0.8時，進行菌液 PCR驗證，并將驗證陽性的菌液送至華大基因測序．取測序正確的菌液提取質(zhì)粒，將 1,μL 提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E．coli感受態(tài)細胞 BL21(DE3)，涂布于含有 100,mg/L氨芐青霉素抗性的 LB平板上，37,℃倒置培養(yǎng)12～16,h．

1.2.4 蛋白的誘導(dǎo)表達

挑取平板上的單菌落接種到 20,mL LB培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素抗性至終質(zhì)量濃度為100,μg/L．37,℃、220,r/min 培養(yǎng)至菌液 A600＝0.6～0.8，按 2%,的接菌量轉(zhuǎn)入 1,L含氨芐青霉素抗性的LB 培養(yǎng)基中，37,℃、220,r/min培養(yǎng)至菌液 A600＝0.6～0.8，降溫至16,℃，加入終濃度為0.5,mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)16,h，離心收集沉淀菌體．

1.2.5 蛋白純化

收集到的菌體沉淀用 Ni Buffer A(25,mmol/L Tris，500,mmol/L NaCl，20,mmol/L Imidazole，pH 7.5)重懸，使用高壓勻漿破碎機進行破碎．先將機器預(yù)冷至 4,℃，破碎時設(shè)定壓力為 800～1,000,MPa，破碎 2～3次，破碎后的菌液于 4,℃、15,500,r/min離心1,h，上清液用0.45,μm濾膜進行過濾，得到粗酶液．

Ni-NTA親和層析：取20,mL Ni Sepharose 6,Fast Flow填料裝入預(yù)裝柱XK-16中，先用水沖洗約3個柱體積至電導(dǎo)穩(wěn)定，再用Ni Buffer A沖洗最少1個柱體積；使用 ?KTA Purifier，以 4,mL/min的流量上樣；上完樣后用Ni Buffer A緩沖液沖洗柱子直至UV吸收峰降至 100以下；設(shè)置 0～100%, Ni Buffer B(25,mmol/L Tris，500,mmol/L NaCl，250,mmol/L Imidazole，pH 7.5)，60,min梯度洗脫，同時設(shè)置收集3.0,mL/管；收集結(jié)束后，SDS-PAGE檢測收集管中的蛋白純度，收集合并較純的目的蛋白．

凝膠過濾層析(分子篩)：根據(jù)目的蛋白的相對分子質(zhì)量選用截留相對分子質(zhì)量為1×104的濃縮管，4,℃、3,000,r/min濃縮較純的蛋白至 1～2,mL；選用HiloadTM16/600,SuperdexTM200,pg進行凝膠層析，先用 Buffer C(25,mmol/L Tris，150,mmol/L NaCl，pH 7.5)沖洗至少1個柱體積平衡柱子；使用?KTA蛋白純化儀，設(shè)置最高柱壓 0.15,MPa，0.5,mL/min流量上樣濃縮好的蛋白；上樣后直接用Buffer C洗脫，同時1.0,mL/管收集洗脫液；收集結(jié)束后，SDS-PAGE檢測收集管中的蛋白純度，收集合并較純的目的蛋白．

1.2.6 蛋白的濃度測定及Western blot分析

根據(jù)目的蛋白的相對分子質(zhì)量大小，可以選擇截留相對分子質(zhì)量為 1×104的超濾管進行濃縮．濃縮到約1,mL，按BCA試劑盒操作步驟繪制標準曲線測定蛋白質(zhì)量濃度，同時SDS-PAGE檢測蛋白純度．利用電轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，隨后用 5%,脫脂牛奶封閉，依次加入 anti-His鼠單抗一抗，羊抗鼠 IgG二抗，最后用 DAB試劑直接在膜上顯色．

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因CrtN的擴增、載體構(gòu)建及測序鑒定

CrtN基因的大小為1,509,bp，外加6個組氨酸標簽，目的基因的大小應(yīng)為1,527,bp．經(jīng)過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后，使用 DNA回收試劑盒對目的片段進行膠回收．取回收的產(chǎn)物 2,μL進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果如圖1所示，條帶大小在1,500,bp左右，與預(yù)期一致．將切膠回收后得到的產(chǎn)物與 pET-46Ek/LIC載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選出陽性菌株，送至北京華大基因研究中心測序，測序結(jié)果表明克隆的基因與原序列一致且已經(jīng)連接在 pET-46,Ek/LIC載體上．

圖1 CrtN基因PCR結(jié)果Fig. 1 PCR result of gene CrtN

2.2 pET-46,Ek/LIC-CrtN的表達純化

將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 E．coli BL21(DE3)表達，培養(yǎng)5,L，加誘導(dǎo)劑IPTG前取出1,mL菌體作誘導(dǎo)前對照．經(jīng)過 Ni-NTA親和層析后，SDS-PAGE分析如圖2所示．

圖2 CrtN Ni-NTA親和層析純化Fig. 2 Result of CrtN purification with Ni-NTA

CrtN 蛋白預(yù)測大小為 5.67×104，在圖 2中，由誘導(dǎo)前后對比可以看到在 5.7×104處有比較明顯的目的蛋白表達條帶，因此 IPTG可以誘導(dǎo)表達出目的蛋白．但經(jīng)過純化發(fā)現(xiàn)，蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，在上清液、流穿及后續(xù)收集中只檢測到極少的目的蛋白條帶，所以考慮添加 Sso7d與 CrtN一起表達，可有助于蛋白以可溶形式表達．

2.3 目的基因CrtN與Sso7d的擴增、載體構(gòu)建及測序鑒定

CrtN的大小為1,509,bp，Sso7d的大小為192,bp，中間添加了 5個氨基酸序列作為 Linker．共設(shè)計了Sso7d連接在 CrtN的 N端與 C端兩種．經(jīng)過Overlapping PCR 得到的目的產(chǎn)物大小應(yīng)為1,716,bp．產(chǎn)物純化后進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果如圖 3所示，得到目的片段與預(yù)期大小相符．將切膠回收后得到的產(chǎn)物與pET-46,Ek/LIC載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選出陽性菌株，送至北京華大基因測序，測序結(jié)果表明克隆的基因與原序列一致且已經(jīng)連接在pET-46,Ek/LIC載體上．

圖3 CrtN連接Sso7d的PCR結(jié)果Fig. 3 PCR result of CrtN gene with Sso7d

2.4 Sso7d-CrtN蛋白的表達純化

將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 E．coli BL21(DE3)表達，大批量培養(yǎng)5,L，加誘導(dǎo)劑IPTG前取出1,mL菌體作空白對照．經(jīng)過 Ni-NTA親和層析后，SDS-PAGE分析如圖 4所示．CrtN 蛋白預(yù)測大小為 5.67×104，Sso7d融合標簽的大小為 7.3×103，因此目的蛋白的大小預(yù)計為 6.4×104，結(jié)果與此相符．由圖 4可以看出，IPTG誘導(dǎo)前后目的蛋白表達條帶沒有明顯的增加，但高壓破碎后的上清液中還是可以看到目的蛋白表達條帶．Ni-NTA親和層析后可以收集到少量目的蛋白，表明有少量蛋白被誘導(dǎo)出來且以可溶形式存在.

收集4—15管較純的目的蛋白，濃縮至1,mL，使用分子篩層析純化，SDS-PAGE分析如圖5所示．由圖 5可以看到 5—8泳道的目的蛋白上方有一條雜帶，而 9—11泳道的目的蛋白下方也有多條雜帶，總體來說目的蛋白較雜且量不多．收集 16—28管目的蛋白．

圖4 Sso7d-CrtN Ni-NTA親和層析純化Fig. 4 Result of Sso7d-CrtN purification with Ni-NTA

圖5 Sso7d-CrtN分子篩層析純化Fig. 5 Result of Sso7d-CrtN purification with GF

2.5 CrtN-Sso7d蛋白的表達純化

蛋白表達純化過程同2.4節(jié)．經(jīng)過Ni-NTA親和層析后，SDS-PAGE分析如圖6所示．由圖 6可知，IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白表達條帶有少量的增加，Ni-NTA親和層析后可以收集到大量的目的蛋白，且蛋白的可溶表達量顯著提升．

圖6 CrtN-Sso7d Ni-NTA親和層析純化Fig. 6 Result of CrtN-Sso7d purification with Ni-NTA

收集 4—18管目的蛋白濃縮至 1,mL過分子篩．經(jīng)分子篩層析后，SDS-PAGE分析如圖 7所示．由圖 7可以看到，目的蛋白量多且純度得到改善．收集18—50管目的蛋白．

圖7 CrtN-Sso7d分子篩層析純化Fig. 7 Result of CrtN-Sso7d purification with GF

2.6 CrtN連接Sso7d的目的蛋白濃度測定及免疫印跡(Western blot)分析

將收集的目的蛋白用截留量為 1×104的超濾管濃縮，使用 BCA試劑盒測定蛋白濃度，得到 pET-46,Ek/LIC-Sso7d-CrtN 蛋白約 1,mg，pET-46,Ek/LICCrtN-Sso7d蛋白約 12,mg．Western blot分析結(jié)果如圖 8所示．由圖 8可知，表達純化得到的蛋白(泳道4、5)與陽性對照(泳道 2)有相同的特異反應(yīng)，而陰性對照(泳道3)沒有條帶，因此證明表達為目的蛋白．

圖8 CrtN連接Sso7d蛋白Western blot分析結(jié)果Fig. 8 Analysis of CrtN with Sso7d with Western blot

3 結(jié) 語

經(jīng)嘗試CrtN無法直接在大腸桿菌中進行高效表達，通過將Sso7d分別連接于CrtN的N端和C端，利用Ni-NTA層析與凝膠過濾層析進行純化，并對它們的表達效果進行比較．實驗結(jié)果表明，Sso7d連接在目的蛋白CrtN的N端和C端對于目的蛋白的表達具有不同影響．當Sso7d連接在CrtN的C端時，目的蛋白表達量顯著提高且可溶表達比例增多. SDSPAGE和Western blot結(jié)果證實，純化所得蛋白為金黃色葡萄球菌 CrtN蛋白，且純度可以用于后續(xù)的蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析工作．此外，有關(guān) Sso7d連接在不同位置對蛋白表達的影響還未見文獻報道，本文的這些嘗試宜可為使用 Sso7d提高蛋白表達工作提供一定的參考．