HS-GC法測(cè)定依魯替尼原料藥中6種殘留溶劑

*何文勝，程偉青，陳 忠

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，福州350007；2.福建省微生物研究所，福建，福州350007）

依魯替尼（Ibrutinib，也稱伊布替尼）是一種罕見侵襲性血癌——套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）[1-4]的治療藥，美國(guó)FDA 授予其突破性治療藥物資格，是突破性藥物+優(yōu)先審評(píng)+加速批準(zhǔn)+孤兒藥，于2013年11月13日由FDA 加速批準(zhǔn)上市（Pharmacyclics公司和Johnson &Johnson 公司）。2015年1 月，其新的適應(yīng)癥被擴(kuò)大至非霍奇金淋巴瘤——巨球蛋白血癥（WM）的治療，成為首個(gè)治療該疾病的藥物，2017年8月該專利藥在我國(guó)正式獲批上市（億珂），價(jià)格昂貴約3萬(wàn)元人民幣/月。目前，孟加拉生產(chǎn)的依魯替尼是全球唯一獲得政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)合法生產(chǎn)的仿制藥。由于專利保護(hù)，我國(guó)還不能合法生產(chǎn)該藥，但鑒于該藥對(duì)治療MCL的優(yōu)異表現(xiàn)，我國(guó)學(xué)者對(duì)依魯替尼的合成研究表現(xiàn)出極大的關(guān)注[5-6]。由于合成路徑不同，各自所用的有機(jī)溶劑也不同。本課題組在依魯替尼合成過程[7]中用到的有機(jī)溶劑主要有異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、DMF 等。

為保證用藥安全，《中國(guó)藥典》和《藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求》對(duì)各有機(jī)溶劑的限量均有規(guī)定。藥品殘留溶劑的檢測(cè)方法有多種[8-9]，如干燥失重測(cè)定法快速簡(jiǎn)便，但一般只能測(cè)定溶劑殘留的總量，專屬性較差；分光光度法通過不同溶劑的特征吸收峰值強(qiáng)度的差異來(lái)檢測(cè)藥物中殘留溶劑，靈敏度較低。易揮發(fā)物質(zhì)一般采用氣相色譜法[10-11]，而頂空氣相色譜法（HS-GC）是許多國(guó)家藥典檢測(cè)藥品有機(jī)殘留溶劑的首選方法[12]，該技術(shù)前處理步驟簡(jiǎn)單，將固態(tài)或液態(tài)樣品中的揮發(fā)性組分加熱揮發(fā)后，直接導(dǎo)入氣相色譜儀進(jìn)行分離和檢測(cè)，且頂空進(jìn)樣體積大于直接手動(dòng)進(jìn)樣體積，靈敏度得到了大幅的提高。鑒于此，本研究中參考了相關(guān)文獻(xiàn)，建立了HS-GC測(cè)定本課題組合成依魯替尼原料藥中殘留溶劑量的方法，快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，以期為依魯替尼原料藥的質(zhì)量控制及監(jiān)測(cè)提供質(zhì)控基礎(chǔ)。同時(shí)，也為其他藥品合成中使用異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、DMF 作為溶劑的藥品，進(jìn)行有機(jī)殘留溶劑檢測(cè)提供參考借鑒。

1 儀器與試劑

Agilent7820A 氣相色譜儀，配FID檢測(cè)器、Agilent7697A 頂空自動(dòng)進(jìn)樣器；載氣為高純氮（99.999%），Agilent GC ChemStation 色譜工作站；電子天平（METTLER AE240，十萬(wàn)分之一）。Milli-Q超純水儀。

依魯替尼原料藥為藥化研究室自制（批號(hào)：EBR031116，EBR031118，EBR031120）。二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、N、N-二甲基乙酰胺(DMA)、DMF、異丙醇均為色譜純（純度＞99.8%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:DB-624（30m×530μm×3μm，美國(guó)Agilent 公司）；升溫程序：初始溫度40 ℃（3 min），升溫至70 ℃（10 /min℃ ），70 ℃（2 min），升溫至200 ℃（20 /min℃ ），200 ℃（5 min）；檢測(cè)器：FID（300℃）；載氣：氮?dú)猓恢魉? mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流方式進(jìn)樣；分流比：8:1；頂空平衡溫度：110 ℃，平衡時(shí)間：30 min；進(jìn)樣量：1 mL。

2.2 溶液的制備

對(duì)照儲(chǔ)備液的制備：分別精密稱取5000 mg 異丙醇、600 mg 二氯甲烷、5000 mg 乙酸乙酯、720 mg四氫呋喃、890 mg 甲苯、880mgDMF，置于同一100 mL 容量瓶中，DMA 定容至刻度，即得（4 ℃保存）。

系列對(duì)照品溶液的制備：分別精密移取對(duì)照儲(chǔ)備液適量，稀釋，即得。

供試品溶液的制備：稱取依魯替尼原料藥樣品約0.5 g，精密稱定，置于頂空瓶（20 mL）中，加入DMA 5 mL 溶解，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液、溶劑空白液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）?？瞻兹軇┎桓蓴_各殘留溶劑的檢測(cè)，且各殘留溶劑的分離度>1.5，滿足檢測(cè)要求。

圖1 專屬性試驗(yàn)氣相色譜圖Fig.1 GC chromatograms

2.4 線性范圍、定量限、檢測(cè)限

取“2.2”項(xiàng)下的系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以溶劑的質(zhì)量濃度（X, μg/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。6種溶劑的線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.998。各溶劑的檢測(cè)限（S/N=3）、定量限（S/N=10)結(jié)果見表1。

表1 6種殘留溶劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Table 1 Equations of linear range，correlation coefficients，LOD and LOQ of 6 residual solvents

2.5 精密度

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液5 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，平行6 份，計(jì)算RSD。各有機(jī)殘留溶劑異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF的峰面積的RSD分別為2.2%，1.8%，1.9%，1.8%，2.0%，2.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性

精密稱取樣品（批號(hào)：EBR031116）0.5 g，平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算RSD。異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF的RSD分別為2.3%，1.7%，1.9%，1.9%，2.1%，2.0%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

《中國(guó)藥典》中異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯和DMF 6種有機(jī)殘留溶劑的限值分別為0.5%、0.06%、0.5%、0.072%、0.089%、0.088%。在樣品（批號(hào)：EBR031116）中按各有機(jī)殘留溶劑限值的80%，100%，120%進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Results of the recovery tests

2.8 樣品的含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：EBR031116，EBR031118，EBR031120）樣品按“2.2”線下方法制備供試品溶液，再按“2.1”頂空氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)試，外標(biāo)法計(jì)算各有機(jī)溶劑的殘留量。結(jié)果顯示：3批樣品均未檢出各有機(jī)殘留溶劑。

3 討論

3.1 原料藥中殘留溶劑考察的意義

化學(xué)原料藥的合成過程中不可避免會(huì)使用各種有機(jī)溶劑溶解各種反應(yīng)原料，有時(shí)選擇合適的溶劑還可在產(chǎn)品精制過程提高產(chǎn)量、決定藥物的純度、晶型。然而，有機(jī)溶劑殘留在藥物中，如果超出安全閾值時(shí)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。

本課題組涉及的有機(jī)溶劑二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和DMF均為中國(guó)藥典（四部0861）規(guī)定應(yīng)限制使用的二類溶劑，限量規(guī)定分別為0.06%、0.072%、0.089%和0.088%，異丙醇和乙酸乙酯為中國(guó)藥典（四部0861）規(guī)定的藥品GMP或其他質(zhì)量要求限制使用的三類溶劑，限量規(guī)定分別為0.5%，因此應(yīng)該對(duì)這六類溶劑進(jìn)行殘留量檢測(cè)。

按本方法進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果表明，本課題組在合成工藝過程中所用的有機(jī)溶劑均未檢出，滿足《中國(guó)藥典》對(duì)有機(jī)殘留量的規(guī)定。作為該新藥研究質(zhì)量控制的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為藥品將來(lái)的生產(chǎn)上市提供有效技術(shù)支持。

3.2 色譜柱的選擇

本次測(cè)定的6種有機(jī)溶劑極性相差較大，根據(jù)相似相容的原理，選擇非極性色譜柱（DB-1、SE-54）或極性色譜柱（FFAP）均不能使極性待測(cè)物或弱極性待測(cè)物得到有效分離。選擇中等極性的色譜柱（如DB-624），可最大地兼容各種極性的待測(cè)溶劑，使檢測(cè)的理論塔板數(shù)（n）、拖尾因子（T）和分離度（R）最優(yōu)化。因此在檢測(cè)有機(jī)溶劑極性跨度大時(shí)，選擇中等極性的色譜柱為宜。

3.3 頂空平衡溫度和平衡時(shí)間的選擇

頂空進(jìn)樣一般將樣品置于密閉容器（頂空瓶），在受控的溫度下加熱，至揮發(fā)性物質(zhì)在氣液兩相中的濃度達(dá)到平衡，因此頂空色譜分析的靈敏度和準(zhǔn)確度取決于平衡溫度和平衡時(shí)間。平衡溫度太低則導(dǎo)致平衡時(shí)間長(zhǎng)，而且溶劑回收率低；平衡溫度高則會(huì)縮短頂空進(jìn)樣設(shè)備的使用壽命，并可能導(dǎo)致溶劑發(fā)生部分分解。為于兼顧效率和靈敏度，一般選擇被測(cè)有機(jī)溶劑沸點(diǎn)偏高的溫度作為平衡溫度，如本實(shí)驗(yàn)6種有機(jī)溶劑，沸點(diǎn)約在40～153 ℃之間，我們選擇了110 ℃作為平衡溫度；而平衡時(shí)間則選擇所有溶劑峰面積增加趨于平緩時(shí)即可。