多西環(huán)素對荷瘤小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中CCAT1、MMP-2及TIMP-2表達的影響①

魏旭靜 李 林 張紅真 王 景 徐 靜

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科,石家莊 050000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，常發(fā)生于老年婦女，近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率逐漸升高，嚴(yán)重威脅女性的生殖健康[1]。導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的危險因素有糖尿病、高血壓、不育和晚絕經(jīng)等，但其發(fā)病機制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(long non-coding RNA colon cancer associated transcript 1,lncRNA CCAT1)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后過程密切相關(guān)[2,3]。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(metalloproteinases-2,MMP-2)屬于明膠酶A，主要作用是消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維，能夠通過破壞局部組織結(jié)構(gòu)促進腫瘤生長，破壞基底膜屏障促進腫瘤轉(zhuǎn)移，通過改建細胞外基質(zhì)促進腫瘤新生血管形成[4,5]。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metallo proteinase,TIMP)是MMPs的天然抑制劑，TIMP-2可通過與活化的MMP-2形成復(fù)合物抑制其活性[6]。多西環(huán)素作為一種四環(huán)素類抗生素，具有抑菌作用，是一種MMPs廣譜抑制劑。前期研究表明：CCAT1通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達和瘤細胞病毒癌基因蛋白的表達發(fā)揮促進子宮內(nèi)膜細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[7,8]。目前尚未發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素對子宮內(nèi)膜癌組織CCAT1、MMP-2、TIMP-2、PCNA 和Ki67表達影響的研究，本研究通過建立子宮內(nèi)膜癌小鼠模型，成瘤后給予多西環(huán)素干預(yù)，觀察CCAT1、MMP-2、TIMP-2、PCNA和Ki67在子宮內(nèi)膜癌組織及正常增生期子宮內(nèi)膜組織的表達水平，分析其表達水平對子宮內(nèi)膜癌的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡健康雌性C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量(22±2)g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(冀)2018-008。飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，濕度(55±5)%，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，經(jīng)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2細胞與試劑 多西環(huán)素購自美國Sigma公司，兔抗人MMP-2和TIMP-2多克隆抗體購自武漢博士德公司，小鼠抗人PCNA和Ki67單克隆抗體購自英國Abcam公司，二抗工作液購自北京杉金橋生物技術(shù)公司，子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞株培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度為1.0×106個/ml。取0.2 ml接種于小鼠右腋外側(cè)皮下，每天觀察成瘤情況，約接種6 d后可見腫瘤開始形成，以移植瘤達到5 mm×5 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，約28 d達標(biāo)[9]。

1.2.2分組與給藥 小鼠40只，隨機分為模型組、多西環(huán)素低、中和高劑量組，低、中和高劑量素組分別腹腔注射5、10、20 mg/ml多西環(huán)素，模型組給予等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥15 d。

1.2.3標(biāo)本采集 連續(xù)給藥7 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織后稱重，計算抑瘤率(inhibition rate，IR)，公式如下：IR(%)=(1-多西環(huán)素組瘤重/模型組瘤重)×100%。稱重后迅速取小塊腫瘤組織置于-80℃保存。

1.2.4HE染色觀察組織形態(tài) 取移植瘤組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，不同濃度乙醇脫水，透明處理，石蠟包埋，切成4 μm的組織切片，常規(guī)HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.5RT-PCR法檢測CCAT1、MMP-2和TIMP-2表達 取移植瘤組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計檢測280 nm波長下總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，置于PCR擴增儀檢測lncRNA CCAT1 mRNA表達水平。通過Primer 5.0軟件設(shè)計引物，CCAT1引物序列：上游5′-CCAATTGAACCGAGCCTTGT-3′；下游5′-TCGTGAGCGTTTTCGCAATG-3′，長度298 bp；MMP-2引物序列：上游5′-AGTGGGACAAGAATCAGATCACAT-3′；下游5′-TCGGTGGTACAGCTGTTGTAAGAG-3′，長度447 bp；TIMP-2引物序列：上游5′-GGCAAGATGCACATTACC-3′；下游5′-TTGACATCCCTTCCTGGA-3′，長度386 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-TCTCTC-TTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′，長度176 bp。PCR擴增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示lncRNA CCAT1 mRNA相對表達量。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測MMP-2、TIMP-2、PCNA和Ki67蛋白表達水平 取腫瘤組織置于10%甲醛固定，采用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成4 μm的組織切片，采用二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，采用3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波抗原熱修復(fù)，分別加入一抗，置于4℃孵育過夜。加入二抗置于37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。每張切片于高倍鏡下取6個視野，測定每個視野的平均光密度值，分別表示MMP-2、TIMP-2、PCNA和Ki67蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1多西環(huán)素對小鼠抑瘤率的影響 與模型組比較，多西環(huán)素低、中和高劑量組小鼠移植瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。多西環(huán)素高、中劑量組小鼠腫瘤抑制率明顯高于低劑量組(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織Fig.1 Endometrial carcinoma tissues of mice in various groupsNote:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

表1 各組小鼠瘤重和腫瘤抑制率比較Tab.1 Comparison of tumor weight and tumor inhibition rate among various

2.2多西環(huán)素對小鼠腫瘤組織病理的影響 模型組小鼠腫瘤細胞排列緊密，形狀不規(guī)則，生長旺盛。與模型組相比，多西環(huán)素低、中、高劑量組小鼠腫瘤細胞體積明顯減小，排列稀疏。多西環(huán)素高劑量組小鼠癌細胞可見大面積壞死核碎裂，周圍組織浸潤減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織HE染色圖(×100)Fig.2 HE staining of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×100)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

2.3多西環(huán)素對小鼠腫瘤組織CCAT1、MMP-2和TIMP-2 mRNA表達的影響 與模型組相比，低、中和高劑量多西環(huán)素組大鼠子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA CCAT1 mRNA相對表達量均明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA CCAT1 mRNA表達水平Tab.2 lncRNA CCAT1 mRNA expression levels of endo-metrial carcinoma tissues of mice among various

2.4多西環(huán)素對小鼠腫瘤組織MMP-2和TIMP-2表達的影響 與模型組相比，多西環(huán)素低、中、高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與多西環(huán)素低劑量組比較，多西環(huán)素中、高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與多西環(huán)素中劑量組相比，高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組小鼠移植瘤組織中MMP-2和TIMP-2蛋白表達比較Tab.3 Comparison of expressions of MMP-2 and TIMP-2 of transplanted tumor in mice among various

2.5多西環(huán)素對小鼠腫瘤組織PCNA和Ki67表達的影響 與模型組相比，多西環(huán)素低、中、高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中PCNA和Ki67蛋白表達明顯降低(P<0.05)，與多西環(huán)素低劑量組相比，中、高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中PCNA和Ki67蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 各組小鼠移植瘤組織中PCNA和Ki67蛋白光密度值比較Tab.4 Comparison of optical density of PCNA and Ki67 transplanted tumor in mice among various

圖3 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織免疫組織化學(xué)圖(×200)Fig.3 Immunohistochemistry of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×200)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重危害女性生殖健康的一種生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，對如何有效抑制子宮內(nèi)膜癌組織惡化是目前臨床腫瘤醫(yī)學(xué)的難題[10]。lncRNAs是指不具有編碼蛋白潛力的長度超過200 bp的RNA，在生命活動調(diào)控過程中起重要作用，包括充當(dāng)信號、引導(dǎo)蛋白和分子支架等方式調(diào)控基因表達。CCAT1是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種具有促癌作用的lncRNA，在多種腫瘤中異常高表達，能夠促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。CCAT1過表達能夠促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12,13]。高金蘋等[14]研究表明，CCAT1參與調(diào)控cMYC基因轉(zhuǎn)錄，增強腫瘤細胞放射敏感性，抑制腫瘤細胞增殖。在MMPs家族中，MMP-2可降解基底膜Ⅳ型膠原，從而促進腫瘤細胞侵襲和播散[15]。

TIMP-2作為腫瘤預(yù)后不良標(biāo)志物，可促進癌細胞增殖，與腫瘤發(fā)展有密切聯(lián)系[16]。TIMP-2是MMPs 的抑制物，隨著MMP-2的表達水平升高而升高[17]。

多西環(huán)素是MMPs的抑制劑，可以通過與MMPs的活性中心Zn2+結(jié)合從而阻斷MMPs的酶活性，同時能夠從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)MMPs mRNA表達，減少MMP-2產(chǎn)生[18]。本研究結(jié)果表明在不同劑量的多西環(huán)素干預(yù)下，能夠不同程度地敲低CCAT1基因，其具體作用機制有待進一步研究，同時低、中和高劑量多西環(huán)素均能減低MMP-2和TIMP-2在腫瘤組織中表達水平，其水平高低與腫瘤細胞的發(fā)展有密切聯(lián)系，與相關(guān)報道結(jié)論一致[19,20]。PCNA 和Ki67是與增殖細胞相關(guān)的核抗原，僅在增殖細胞中合成表達,尤其在惡性腫瘤細胞中呈高表達，通常作為評估細胞增殖活性的指標(biāo)[21]。一般情況下，增殖期細胞比例越高，PCNA 和Ki67陽性率越高，腫瘤生長快，惡性程度高[22]。本研究結(jié)果表明，模型小鼠給予不同劑量多西環(huán)素干預(yù)后，腫瘤組織中PCNA和Ki67表達明顯降低，說明多西環(huán)素對腫瘤細胞的增殖有一定抑制作用。

綜上所述，多西環(huán)素對荷子宮內(nèi)膜癌小鼠移植瘤生長和腫瘤細胞增殖有一定抑制作用，其作用機制可能與下調(diào)CCAT1、MMP-2表達水平，上調(diào)TIMP-2表達水平有關(guān)。